環境激素聯合冷刺激誘導建立慢性少精子癥大鼠模型的實驗研究*

美合日古麗·薩塔爾 張盼盼 王天宇 艾孜孜·熱合曼蔣丹丹 斯依提·阿木提 阿地力江·伊明*

新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室（烏魯木齊 830011）

由于環境因素、工作壓力、行為模式和飲食結構的改變，人類的生殖健康面臨著巨大的威脅。有文獻報道[1,2]，近50年來人類精子質量不斷下降，成年男性精液量及精子數量下降了近50%，且呈繼續下降趨勢。因此，少精子癥的研究亦越來越受到諸多學者的廣泛關注[3,4]。環境雌激素（environmental estrogens，EEs）及冷刺激可直接或間接影響動物生殖系統，但具體不詳，有關模型更是鮮有報道。故本研究以3種雌激素樣飼料分別聯合冷刺激復合干預的方法，就誘導慢性少精子癥大鼠模型進行了研究，并從精子濃度、精子活率改變，睪丸及附睪形態學變化，以及Johnson評分，對少精子癥模型進行了綜合評價，初步確定了最佳建模方法，并圍繞其性腺軸內分泌激素的改變進行了初步的機制探討，為基于該模型基礎上的基礎與應用研究奠定了基礎。

材料和方法

一、實驗動物

性成熟雄性SD大鼠84只，平均質量（220±10）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

二、主要儀器與試劑

冷凝機、DRS-09A型超聲波加濕器（杭州多樂信電器有限公司）、BS-1150型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）、Carl Zeiss多功能掃描電子顯微鏡 （德國蔡司公司）。M199細胞培養液（HyClone公司，批號：No.SH30253.01）、水合氯醛 (索來寶公司，批號：No.327D021）。

飼料配制：特殊飼料A為70%常規大鼠飼料與15%菠菜實、15%芫荽實，飼料B為70%常規大鼠飼料與30%的芫荽實，飼料C為70%常規大鼠飼料與30%菠菜實。

三、實驗方法

（一）實驗分組與動物模型的建立

隨機取12只正常雄性大鼠為正常對照組（N組），余72只為造模組A、B、C組。A飼料+冷刺激組（簡稱A組），B飼料+冷刺激組 （簡稱B組），C飼料+冷刺激組（簡稱C組），每組24只。N組大鼠常規飼養，溫度為（25±2）℃，濕度為（55±5）%，造模組大鼠置于氣候箱[溫度 （10±2）℃、 濕度 （75±5）%] 的環境中飼養，9：00～19：00放入。干預24周后，檢測各組大鼠精子濃度，分別篩選出精子濃度低于N組50%的少精子癥大鼠模型，分別設為 A2、B2、C2組，未成模者設為 A1、B1、C1組。

（二）取材

建模24周后，7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，離心取上清。取雙側睪丸、附睪分別稱量，一側睪丸與附睪常規光、電鏡標本固定。取另一側附睪尾，在M199培養液中 （含有2%BSA）剪碎，37℃孵育15min，參照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)[5]進行精子計數并計算精子濃度。然后按照文獻[6]進行睪丸Johnson評分。

（三）血清激素水平檢測

按照放免試劑盒說明書對大鼠睪酮 （T）、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）和催乳素（PRL）進行檢測。

四、統計分析

采用SPSS22.0進行統計分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法進行檢驗，計數資料以百分比(%)表示，組間率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組精子濃度、活率、運動能力變化及成模率結果

結果顯示，A、B、C 3組大鼠精子濃度與活率較N組均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示，A、B、C 3 種均可導致大鼠精子濃度與活率顯著降低（表1）。經按照低于N組50%作為標準篩選少精子癥模型后，A、B、C 3組成模率分別為 28.6%、38.1%、28.6%。 A2、B2、C2組大鼠精子濃度、活率及運動能力均顯著低于N組(P＜0.01)，提示，在形成少精子癥同時，出現了精子運動力減弱，同時，B2組精子濃度顯著低于 A2、C2組(P＜0.05，表 2，圖 1）。

表1 各組大鼠精子濃度、精子活率變化(±s)

表1 各組大鼠精子濃度、精子活率變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B 組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

N組 A組 B組 C組精子濃度（×106/mL） 17.06±5.03 11.94±4.88* 11.70±7.68* 11.92±7.84*精子活率（%） 52.52±14.72 21.96±3.83** 12.12±3.76** 19.61±5.07**

表2 各組大鼠精子濃度、運動能力及活率變化(±s)

表2 各組大鼠精子濃度、運動能力及活率變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

A組 B組 C組A1組 A2組 B1組 B2組 C1組 C2組精子濃度（×106/mL） 17.06±5.03 14.81±4.77 8.09±1.41**△ 19.50±5.80 4.39±2.96** 17.52±7.14 8.32±1.89**△精子活率（%） 52.41±14.72 39.10±15.89 34.83±10.78** 39.71±16.08 27.06±17.56** 38.44±16.13 32.09±8.62**精子運動能力（%） 28.86±10.35 17.42±19.43 13.15±7.19** 18.36±14.15 12.45±9.96** 11.65±10.04* 10.65±7.79**N組

圖1 各組大鼠精子伊紅-苯胺黑染色圖

二、睪丸、附睪質量結果

睪丸質量A2、B2、C2組顯著低于N組差異具統計學意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，B2組顯著低于 A2、C2組(P＜0.01)。 附睪重量 A2、B2、C2組顯著低于 N 組 (P＜0.015，表 3，圖 2、3)。

表3 N及模型組大鼠睪丸和附睪質量變化(±s)

表3 N及模型組大鼠睪丸和附睪質量變化(±s)

注：與 N 組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較 △P＜0.05，△△P＜0.01

N組 A2組 B2組 C2組睪丸（g） 1.75±0.19 1.34±0.46*△△ 0.80±0.33** 1.39±0.40*△△附睪（g） 0.82±0.07 0.61±0.08** 0.55±0.07** 0.63±0.17**

圖2 N組及模型組大鼠睪丸大小

圖3 N組及模型組大鼠附睪大小

三、睪丸、附睪光鏡觀察結果

N組睪丸、附睪光鏡下組織形態結構正常。A2、B2、C2組睪丸各級生精細胞排列紊亂，生精細胞、精子及間質細胞數量均減少，其中B2組生精細胞與精子數量減少最為明顯。A2、B2、C2組附睪管腔內精子數量減少，其中B2組附睪管壁明顯增厚，管腔內精子數量也明顯減少（圖4、5)。

圖4 N組及模型組大鼠睪丸H-E染色結果

圖5 N組及模型組大鼠附睪H-E染色結果

四、大鼠睪丸、附睪電鏡觀察結果

N組睪丸、附睪組織形態結構均正常。A2、C2組睪丸生精小管內見少量精母細胞和精子細胞及少量精子，少量生精細胞核消失，異染色質增多，支持細胞數量減少。少量線粒體出現空泡樣變。B2組睪丸生精小管內可見精原細胞、精母細胞核固縮，支持細胞核溶解并數量減少。A2、C2組附睪靜纖毛排列較整齊，細胞間隙增大，管腔內精子數量減少；B2組附睪靜纖毛排列紊亂，細胞間隙明顯增大，且管腔內精子數量極少（圖 6）。

圖6 N組及模型組大鼠睪丸、附睪電鏡結果（×2500）

五、大鼠睪丸Johnson評分結果

A2、B2、C23組睪丸 Johnson評分結果顯著低于 N組，差異具統計學意義(P＜0.01)；同時，B2組亦顯著低于 A2和 C2組，差異具統計學意義（P＜0.01，表 4）。

表4 N及成模組大鼠睪丸Jonhsen評分結果(±s)

表4 N及成模組大鼠睪丸Jonhsen評分結果(±s)

注：與 N組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 B2組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 Jonhsen評分N 組（n=15） 9.10±0.78 A2 組（n=15） 5.30±1.05**△△B2 組（n=15） 3.10±0.99**C2 組（n=15） 5.70±0.94**△△

六、血清激素水平檢測結果

B2組T水平較N組T水平顯著降低，E2水平顯著升高差異均具統計學意義（P＜0.01）。FSH、PRL水平B2亦較N組亦顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。LH水平B2組較N組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05，表5）。

表 5 血清 T、E2、LH、FSH、PRL 水平變化(±s)

表 5 血清 T、E2、LH、FSH、PRL 水平變化(±s)

注：與 N 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

N組 B2組T（ng/dL） 1.36±0.66 0.24±0.13**E2（uIU/mL） 38.27±6.75 77.90±8.54**LH（mIU/mL） 4.48±1.70 5.66±1.07 FSH（mIU/mL） 5.20±2.54 10.53±4.09*PRL（pg/mL） 80.94±37.42 148.35±39.14**

討 論

不孕不育癥的發生約為育齡夫婦的10%～15%，其中男性因素占40%～60%[7,8]。文獻研究表明[9]精液異常導致的男性不孕不育約占70%～80%，其中少精子癥、弱精子癥和少弱精子癥分別占男性不孕不育的10%、30%和40%～50%[10-12]。在眾多因素當中由于環境因素的影響，男性無精子癥、少精子癥、少弱精癥等疾病的發生率逐年增加[13]。因此，開展該領域的研究具有重要意義。同時，因倫理因素，很多研究需要借助動物模型來開展，故建立與臨床吻合度較高，且具有良好的科學性、穩定性的動物模型成為必須。

常見的環境因素包括電離輻射、重金屬污染、環境激素污染與氣溫因素等等[14]。這其中EEs是一類對男性生殖系統影響最大的外源性內分泌干擾物之一，包括合成性EEs、植物性EEs及真菌性EEs等[15]。而作為環境因素中的氣溫因素，即冷、熱刺激對人類的健康亦有著不同的影響，尤其長期的寒冷環境，可對生殖健康帶來不同程度的損傷，秋冬季節更是心、腦血管等疾病的高發季節[16,17]。考慮到以上因素，本研究分別選用富含異黃酮、雌二醇、雌三醇等植物雌激素的芫荽和菠菜等植物[18,19]，制作3種雌激素樣飼料，模擬了食源性植物雌激素污染，并聯合冷刺激復合干預的方式，研究了3種條件下建立復合型少精子癥模型的可行性和科學性，并在此基礎上探討了其可能的機制。

結果顯示，A、B、C 3種條件下均會導致精子濃度顯著降低，干預24周后A、B、C 3組大鼠精子濃度較N組均顯著降低（P＜0.05），并形成少精子癥。關于少精子癥模型的建立，目前采用腺嘌呤、環磷酰胺、棉酚、熱應激等化學與物理方法較多[20]，上述模型在一定程度上較好的解決了少精子癥科學研究模型需求，同時也還存在與產生少精子癥的實際環境條件的吻合度上尚有一定差距。而在少精子癥的評價方面，學者們采取的標準也不盡一致，有學者以模型和正常對照組之間精子濃度具有顯著性差異作為標準[21-23]，也另有學者將精子濃度低于正常對照組的30%、20%設為少精子癥模型標準[24,25]。而本研究，則在此基礎上，結合WHO（第5版）對人類少精子癥的診斷標準，參考學者張才田、Kesari等標準[26,27]，以降低50%作為少精癥模型的標準進行了篩選。結果顯示，A、B、C 3組成模率分別為 28.6%、38.1%和28.6%，B2組明顯高于其他兩組，但經統計學處理，無顯著性差異（P=0.744），這可能與樣本量有關，尚需進一步研究來明確。精子濃度比較后可見，B2組大鼠精子濃度顯著低于A2、C2組（P＜0.05）。對男性生殖腺睪丸和精子的成熟器官附睪的研究結果顯示，A2、B2、C23組睪丸和附睪的質量均顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），與 A2、C2以 B2組最為顯著（P＜0.01）。 光、電鏡下A2、B2、C23組睪丸和附睪均發生不同程度的病理性改變，且以B2組最為明顯，表現為睪丸內生精小管內精子數量明顯減少或無精子，見精原細胞、精母細胞核固縮，支持細胞核溶解并數量減少，大量線粒體出現空泡樣變；附睪管內見極少量的精子，且靜纖毛排列紊亂等改變。而Johnson評分結果顯示，A2、B2、C23組均較N組顯著降低 (P＜0.01)， 同時，B2組顯著低于A2、C2組(P＜0.01)。對上述各項指標綜合分析后，筆者認為，上述3種不同雌激素樣飼料聯合冷刺激的方法均可建立少精子癥模型，但其中芫荽實聯合冷刺激的方法效果最佳，具有成模率高，精子數量減少顯著，病理變化明顯等特點。

性腺軸激素檢測結果顯示，B2組T水平較N組顯著降低（P＜0.01），E2水平較 N 組顯著升高（P＜0.01），FSH、PRL 水平亦顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。 提示芫荽實聯合冷刺激致大鼠精子數量減少并最終發展為少精子癥，同時伴發弱精子癥的機制可能與T水平降低、E2水平升高，并引發性腺軸功能紊亂有關。具體機制而言，可能和EEs競爭性的結合在E2受體上，抑制負反饋調節作用，促進正反饋調節LH的分泌，進而刺激E2的分泌有關[28]，同時睪丸細胞暴露在高雌激素環境時，類固醇合成酶的表達下降，亦可導致T水平進一步降低[29]；另外也有可能與EEs促進PRL、性激素結合蛋白的表達和分泌，使抑制素B及雄烯二酮水平降低，擾亂激素的平衡[30]，并因長期冷刺激，引發慢性應激反應，進一步導致性腺軸激素紊亂，并最終導致生殖功能損傷有關，但尚需進一步研究予以論證。

綜上所述，上述3種不同雌激素樣飼料聯合冷刺激的方法均可建立少精子癥模型，但其中以芫荽實聯合冷刺激的方法效果最佳，其具體發生機制和性腺軸內分泌功能改變有關。該模型且較好的模擬了少精子癥的慢性發病過程，為基于該模型的基礎上的基礎與應用研究奠定了良好的基礎，并為環境復合因素作用下少精子癥及少弱精子癥的發病機制研究開拓了新的思路。