卵巢癌患者血游離DNA的臨床研究

劉俊寶，曹 璐，秦 瑞，沈美娜

(吉林大學中日聯誼醫院 婦產科，吉林 長春130033)

卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，致病因素中遺傳和環境因素逐漸受到重視。大多數外源性致癌物進入人體之后經過兩個階段代謝[1]，(1)經Ⅰ相代謝酶啟動致癌過程；其典型代表是CYP450家族中的CYP1A1基因，而該基因中的MSPI多態性成為了主要的研究對象。(2)由Ⅱ相代謝酶發生解毒反應。比較有代表性的物質當屬谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)中的GSTT1。因此，人體對腫瘤的易感性有可能與人體發生解毒代謝作用失衡和Ⅰ、Ⅱ相代謝酶將致癌物加以激活存在一定的關系。微衛星不穩定性(MSI)只在各種腫瘤組織中表達，使其成為腫瘤分子生物學中繼抑癌基因和癌基因的研究后新出現的又一研究熱點。本研究主要是從91例卵巢癌患者靜脈血中提取DNA，然后進行CYP1A1MSPI多態性、GSTT1多態性及MSI的檢測，為卵巢癌的早期診斷、評估以及預后提供一定的理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1標本 卵巢癌組：研究以回顧性分析法從2005年到2007年期間吉林大學中日聯誼醫院婦科所收治的，并經手術術后病理確診為卵巢癌的患者中優選91例作為研究對象。對照組：在相同時期內所收治的15例沒有出現遺傳性病變的卵巢良性腫瘤患者。卵巢癌組中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期的患者人數依次為23例(25.27%)、11例(12.09%)和57例(62.64%)。卵巢癌組臨床病理類型：卵巢上皮性惡性腫瘤(共70例，占76.92%)，其中漿液性囊腺癌46例、黏液性囊腺癌12例、子宮內膜樣癌10例、庫肯勃瘤2例；卵巢非上皮性惡性腫瘤(共21例，占23.08%)其中生殖細胞惡性腫瘤10例，包括無性細胞瘤3例、惡性畸胎瘤2例、內胚竇瘤5例；性索間質惡性腫瘤6例(全部為顆粒細胞瘤)；卵巢轉移癌5例。

1.1.2試劑 taq酶、 dNTP、 EB、聚丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均購自北京鼎國生物技術有限責任公司。DL-2000 DNA MARKER購自大連TAKARA 公司。

1.2 方法

首先對三組患者進行血液標本的采集。采用回顧性分析法分析目標組患者的一般資料，然后采用常規酚-氯仿抽提基因組DNA，并進行特異性引物的設計，借助PCR-RFLP和PAGE-SSCP對該組患者血液標本中GSTT1基因多態性、CYP1A1基因MSPI多態性和MSI進行分析并判斷其與卵巢癌易感性之間的關聯。然后對其行測序驗證處理，將實驗結果與GenBank數據庫資料進行對比分析，分析三者與卵巢癌患者臨床病理分期和病理類型等之間的關聯關系。

1.3 統計學分析

本研究所有實驗數據經Excel初步處理后選用SPSS 18.0進行統計學分析。其中計數資料和臨床資料依次選用比值比和描述性分析(包括構成比、中位數和率的分析)。另外對計數資料行卡方檢驗，旨在對比基因型在對照組和卵巢癌組中存在的差異。

2 結果

2.1 MSI在卵巢癌組織中的表達情況及與卵巢癌臨床病理特征的關系

2.1.14個微衛星位點PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳結果 見圖1-4，從圖中我們可以發現其PCR擴增結果均為單一條帶，且有著和引物設計的目的產物片段相同的長度。

圖1 D5S346位點PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 D7S486位點產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 D11S904位點產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖4 D7S522 的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.1.2PCR產物后的聚丙烯凝膠電泳 通過對比機體外周靜脈血DNA的擴增后行PAGE的條帶發現當癌組織DNA的微衛星位點等位基因出現減少或增多的時候，此時可以認定為MSI。除此之外，研究還針對全部的存在可疑病例和陽性病例給予二次PCR和電泳確定。本研究發現，在卵巢癌患者中，對其行PCR沒有發現其出現了條帶的遷移、缺失和增多等癥狀。通過對PCR產物進行PAGE分析發現樣品有一部分發生條帶增多，其中多出電泳帶的樣本就是發生MSI的樣本，結果見圖5-6。

圖5 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖6 上述PCR產物的相對應的聚丙烯凝膠電泳圖譜

2.1.3測序結果 對本研究中PAGE出現的多余條帶和PCR產物瓊脂糖凝膠電泳一條帶實施測序分析。對疑有突變樣本的基因和各微衛星位點的測序結果實施網絡比對分析，結果發現其存在五處點突變，具體為：第5位和12位核苷酸發生C缺失；第164位和181位的C依次突變成為了A和G；而第185位上的核苷酸A則突變成了G。通過對全部疑似突變的樣本實施測序比對分析。微衛星不穩定性與卵巢癌之間的關系見表1、表2。

表1 卵巢癌不同類型和MSI之間的關聯

表2 卵巢腫瘤和MSI發生率之間的關聯

2.2 CYP1A1基因MSPI多態性在卵巢癌中的表達情況及與卵巢癌臨床病理特征的關系

2.2.1CYP1A1基因MSPI多態性的檢測結果 CYP1A1基因的MSPI多態性具有A、B、C三種基因型，分別為野生型T/T；雜合型T/C； 突變純合型C/C。給予所有卵巢癌患者實施CYP1A1基因MSPI多態性檢測發現A、B和C基因型依次為50例(55%)、28例(31%)和13例(14%)。

2.2.2CYP1A1基因MSPI多態性與卵巢癌病理類型之間的關系 該基因A基因型組卵巢上皮性癌42例，卵巢非上皮性惡性腫瘤8例；B基因型組與C基因型組卵巢上皮性癌及卵巢非上皮性惡性腫瘤分別為17例及11例、11例及2例。對各個基因型組比對其卵巢非上皮性惡性腫瘤和上皮性惡性腫瘤發現，就病理類型構成比而言具備差異顯著性。

2.3 GSTT1基因多態性在卵巢癌中的表達情況及與卵巢癌臨床病理特征的關系

2.3.1PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳結果 結果顯示GSTT1基因PCR擴增產物長度為450 bp，而GAPDH基因的PCR擴增產物長度則為746 bp。給予所有擴增產物實施瓊脂糖凝膠電泳后根據其出現條帶的數據可以判斷為何種基因。例如當出現兩條帶時(450 bp和746 bp)可以判斷其為GSTT1功能型(+/+)基因型，反之出現一條帶時(746 bp)，則被認為是GSTT1缺失型(null)基因型。其PCR擴增結果如下圖7所示。

圖7 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

在上圖7中的電泳譜圖中出現五條電泳道，其中第一條、二條、三條、四條和五條電泳道依次表示為DNA分子量的標記帶、卵巢癌組樣本、卵巢癌組樣本、對照組樣本和對照組樣本。其中第一條譜帶從下到上依次是100、250、500、1000和2 000 bp。第二條只有一條譜帶(746bp)，第三條有兩條譜帶，從下到上依次是450和746 bp。通過譜帶可以確認其為GSTT1功能型基因型。

就GSTT1缺失型基因型分布頻率來說，對照組和卵巢癌組依次是14%(7/50)和35.1%(32/91)，經χ2檢驗兩組相比較有顯著性差異(χ2=6.205，P<0.05)。所以考慮GSTT1基因缺失可能增加患卵巢癌的風險。

2.3.2GSTT1基因多態性與卵巢癌臨床分期的關系 患者早期(Ⅰ-Ⅱ期)和晚期(Ⅲ-Ⅳ期)GSTT1缺失型基因型頻率分布分別為41%和32%，通過兩組數據的卡方檢驗結果顯示其并無統計學意義。具體數據如下表3所示。

表3 GSTT1基因缺失與卵巢癌分期的關系

2.3.3GSTT1基因多態性與卵巢癌病理類型的關系 GSTT1缺失型(null)基因型在卵巢上皮性惡性腫瘤和卵巢非上皮性惡性腫瘤中分布頻率分別為43%(30/70)、14%(3/21)。GSTT1基因缺失在卵巢上皮性惡性腫瘤與對照組相比發現其具備統計學意義，但是對卵巢非上皮性惡性腫瘤而言與對照組相比其并不存在顯著性差異。具體如下表4所示。

表4 GSTT1基因缺失與卵巢癌病理類型的關系

3 討論

卵巢癌是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，70%以上的患者發現時己屬于晚期。而卵巢癌患者的外周血液中游離循環DNA會出現顯著性提升，我們通過對血漿/血清DNA進行定性分析，針對其存在的腫瘤基因進行特異化檢驗，以期待探索一種新的可用于卵巢癌早期診斷和療效監控的方法。

CYP1A1是細胞色素P450(Cyto-chrome P450,CYP)家族的一名成員,是活化二惡英等環境毒素的主要酶類[2]，它能夠將一些毒素和致癌物質活化成為有很強親電性的終產物或中間產物，之后通過和細胞內RNA、DNA以及蛋白質親核基團等物質相互發生作用，進而導致細胞結構發生破壞，酶失活或出現功能障礙，繼而導致體內某些基因表達異常或直接發生基因突變，促使細胞受到損傷，表現出發生腫瘤或程序性衰亡癥狀[3]。截止到目前為止，通過對CYP1A1基因的研究顯示在其上面存在4個位點多態性(如CYP1A1基因MSPI多態性等)。本研究也發現，卵巢惡性腫瘤的患者中確實存在CYP1A1基因MSPI多態性，所以考慮CYP1A1基因多態性可以從惡性腫瘤患者的循環DNA中進行檢測。本實驗通過對卵巢癌組行GSTT1多態性檢測顯示，該基因的缺失促使患者患上卵巢癌的概率發生上升，因此可以認為GSTT1基因有可能是卵巢上皮性癌的易感基因。

微衛星不穩定的發生目前認為主要是錯配修復基因的改變，正因為這一改變，才使得復制錯誤、錯配堿基得不到正常的校正和修復，進而促使微衛星DNA發生變化，最終影響該DNA的正常調控，同時基因的穩定性也跟著發生變化，進而提升基因突變的概率，促發了惡性腫瘤的形成。本次研究結果表明，微衛星不穩定除了與患者的病理類型存在一定的關聯以外還影響卵巢癌的分期。因此，我們認為，MSI很可能是腫瘤發生進展的一種體現。

采用特異性高的以PCR為基礎的血液分析，檢查兩個基因標記物和微衛星不穩定，會提高試驗的特異性和敏感性，有助于腫瘤的診斷。在其早期，通過動態性監測給予腫瘤患者治療方案的確定提供一定的理論支撐，同時這種檢查也會更容易被患者所接受。但是目前，受制于血液循環DNA量的改變，對腫瘤進行定性和定量診斷還有相當的難度。與此同時，因為腫瘤組織的異質性等原因，有部分檢測結果會表現出假陽性或假陰性，這樣就對腫瘤的早期診斷產生嚴重的干擾。當前針對在臨床上應用循環血DNA檢測還有待進一步的研究[4]。但依照其發展前景來看，其勢必會成為臨床研究的一大熱點。