基于基因芯片技術研究焦慮抑郁障礙對女性高血壓患者基因表達譜的影響

郜 琳，王 倩，劉永政

(秦皇島市第一醫院 1.老年病二科；2.心血管病一科，河北 秦皇島066000)

根據世界衛生組織的數據，全球大約三分之一的成年人伴有血壓升高，其中一半的人將罹患中風或心臟疾病[1]。隨著經濟的高速發展，社會節奏不斷加快，越來越多的人患有焦慮抑郁障礙(ADC) 等精神疾病。研究表明，ADC與多種疾病的發生發展密切相關[2]。流行性病學調查表明，焦慮使非高血壓人群患高血壓風險增加約2倍，抑郁使非高血壓人群患高血壓風險增加約3.5倍[3]。為了進一步探索ADC在高血壓中的潛在機制，我們選取女性高血壓伴或不伴ADC患者作為研究對象，通過基因芯片檢測，從而進一步了解ADC對高血壓患者基因表達譜的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年10月至2017 年10 月在我院門診和住院診治的老年女性原發高血壓并患ADC的患者(平均年齡：65±1.0歲)10例作為研究對象(ADC組)。同時，選取同期老年女性原發高血壓不伴ADC的患者(平均年齡：65±1.0歲)10例作為對照組(Control 組)。原發性高血壓根據WHO原發性高血壓診斷標準[4]。排除既往有惡性腫瘤，急性心肌梗死，心功能不全，心臟瓣膜病，藥物或酒依賴，精神病病史及病情嚴重者。兩組患者對試驗操作和目的均充分了解并簽署了知情同意書。

1.2 ADC診斷方法

在患者就診時，3名經過嚴格訓練的專業人員分別對病人進行問卷調查，利用HADS量表對患者的精神狀態進行評估。ADC診斷符合中國精神障礙分類與診斷標準第3版診斷標準(CCMD-3)[5]。HADS由焦慮(HADS.A) 14 項評分和抑郁(HADS.D) 17 項評分兩部分組成。項目評分為0-3分，焦慮和抑郁總分為21分。本研究選取>8分作為篩選臨界值(>8分認為有焦慮或抑郁癥狀，記為ADC陽性)。

1.3 方法

確診后次日7時，分別采集Control 組和ADC組患者空腹血液標本10 ml，并分裝為2管(其中1管用于基因檢測，另一管用于PCR驗證)，保存于-80℃冰箱中備用。北京博朗生物科技公司進行基因芯片制備、RNA 標記、芯片雜交和芯片掃描實驗。

在本研究中，我們利用String在線工具(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析差異表達基因間的可能內部聯系。差異表達基因的基因本體論(GO)分析被用于注解基因和基因產物，包括生物學過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)三大類信息[6]。京都基因與基因組百科全書(KEGG)是基于基因功能的系統性分析，包括一系列基因組和酶的方法[7]。String在線工具10.0版本包括取自2031個器官的9,643,763種蛋白[8]。String數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)被用于評估和檢測蛋白與蛋白間的相互作用，包括直接和間接的聯系。為了評估不同差異表達蛋白間的相互聯系，我們根據通路和功能富集分析，使用String在線工具建立了差異表達蛋白間的蛋白相互作用(PPI)網絡。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計數據處理。計量資料以均數±標準差(means±SD)表示。各組間差異采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因芯片結果

與Control 組比較，ADC組共有287基因表達上調，141個基因表達下調。根據差異倍數(Fold Change,FC)，分別將表達差異最大的10個基因篩選出來(見表1，2)。

2.2 差異表達基因的GO分析

通過利用STRING數據庫 (https://string-db.org/cgi/input.pl)去評估和預測Control 組和ADC組差異表達基因可能存在的直接或間接的聯系。結果表明，BP共涉及9種：腎素-血管緊張素對血液量的調節、肽激素處理、醛固酮生產的腎素-血管緊張素調節、血管大小調節、全身動脈血壓調節、腎素-血管緊張素對全身動脈血壓的調節、血液中血管緊張素水平的調節、血管緊張素成熟過程、β-淀粉樣蛋白代謝過程(圖1A)。CC為膜筏(圖1B)。MF主要以基因產物生物活性為特征，包括特異性綁定到配體或結構。本試驗中MF為：緩激肽受體結合，受體結合(圖1C)。

表1 Control 組和ADC組差異表達基因(上調)

2.3 差異表達基因的KEGG分析

結果表明，明顯富集的信號通路為：腎素-血管緊張素系統(圖1D)。

表2 Control 組和ADC組差異表達基因(下調)

圖1 差異表達基因的GO分析和KEGG分析

利用String在線工具，分析Control 組和ADC組差異表達基因。(A)GO分析的BP分類 (B) GO分析的CC分類 (C) GO分析的MF分類(D) 不同組的KEGG信號通路分析。

2.4 差異表達基因蛋白-蛋白相互作用網絡分析

所有差異表達基因總共包括13個節點，6條線。 所有差異表達基因共有6種配對關系。該配對關系分別為：ACE-AGTR1(0.955)，ACE-REN(0.955)，AGTR1-REN(0.947)，AGTR1-CD4(0.912)，NPPA-REN(0.702)，NPPA-ACE (0.596)(圖2)。

3 討論

高血壓是一種以動脈收縮壓和舒張壓升高并伴心、腦、腎和視網膜等器官受累為特征的全身性疾病。高血壓對患者的生命安全有極大的威脅，是心血管疾病死亡的主要原因[9]。隨著生活節奏的加快，人們的心理負擔、生活壓力不斷加大，從而導致利用String數據庫，分析Control 組和ADC組差異表達蛋白間的相互作用網絡。每個彩色圓球代表一種蛋白，每一條直線代表某兩個蛋白間的相互聯系。

圖2 差異表達基因的PPI分析

高血壓的發病率也逐年遞增。在環境因素刺激下，患者將反復出現明顯的精神緊張、焦慮、煩躁等情緒波動，較大的情緒變化促使大腦皮層異常興奮，交感神經活動增強，抑制平衡失調，從而使小動脈收縮，周圍血管阻力上升，血壓升高[9]。獨立研究、系統綜述及薈萃分析證據表明，焦慮是慢性身體疾病發生發展的一個獨立風險因素，其與高血壓、糖尿病、冠狀動脈性心臟病等多種慢性疾病都有著密切的聯系[10-12]。研究表明，ADC將導致自主神經功能的改變，包括激活交感神經和抑制副交感神經，從而升高血壓。此外，ADC將導致下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂，進而引起促腎上腺皮質激素對促腎上腺皮質激素釋放激素的反應性增強，增加促腎上腺皮質激素和皮質醇的分泌與釋放，最終導致心排出量增加，血壓升高[13]。

在本研究中，我們收集符合條件的高血壓患者作為研究對象，同時利用HADS量表對患者的精神狀態進行評估。此外，我們采用基因芯片技術對Control 組和ADC組差異表達基因進行分析。結果顯示，與Control 組比較， ADC組共有287基因表達上調，141個基因表達下調。然后，我們根據FC分別將表達差異最大的10個基因篩選出來，并利用String在線工具對這20個基因關系進行分析。

結果顯示，腎素-血管緊張素對血液量的調節，醛固酮生產的腎素-血管緊張素調節，血管大小調節，血液中血管緊張素水平的調節，以及腎素-血管緊張素系統等與高血壓伴ADC明顯相關。在這表達明顯差異的基因中，REN、ACE是2個與高血壓密切相關的基因。

過去研究發現，ACE(血管緊張素Ⅰ 轉換酶)基因與冠心病、心肌梗死、原發性高血壓、糖尿病腎病等疾病密切相關。胡福莉等指出，ACE基因插入缺失多態性與高血壓左室肥厚有關[14]。本試驗通過基因芯片檢測，結果發現ADC組較Control 組REN明顯上調，ACE明顯下調，這可能預示著ADC在加重高血壓患者病情過程中是通過調節REN和ACE基因的表達。