醫用自交聯透明質酸鈉凝膠預防宮腔粘連的有效性動物實驗研究

鄧宇鵬,王秋石,高麗娟,劉崇東

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院,北京100020)

宮腔粘連(Intrauterine adhesions,IUA)是宮腔操作的嚴重并發癥，可引起不孕、月經過少、閉經或反復流產[1]。隨著宮腔鏡技術的發展，近年IUA的發病率和檢出率呈上升趨勢，已成為女性繼發不孕的第二大病因[2]。目前，臨床對IUA的治療盡管能恢復宮腔的形態，但對子宮生理功能的恢復尚不能有效解決，導致IUA的治愈率和妊娠率無明顯改善，而且中重度IUA治療后的復發率較高[3]。因此，IUA仍是臨床治療的難題，IUA的預防更為重要。

目前IUA的預防方法有術后放置Foley球囊、節育環，以及雌激素/孕激素聯合治療等，但存在各種局限性。透明質酸鈉具有良好生物相容性和生理功能，近年來也被用于IUA的預防[4,5]，但由于其易從宮腔流出(粘度低)和降解吸收過快(1-2天)的缺點，因而并未能在臨床上得到較好的推廣使用。交聯透明質酸鈉凝膠克服了透明質酸鈉的缺點，具有很高的粘度，可在宮腔局部充填停留；同時也顯著延緩了體內降解吸收的時間(1-2周)，與粘連預防的關鍵期限5-7天相匹配[6,7]，因而較好地預防了IUA[8,9]。醫用自交聯透明質酸鈉是一種新型交聯透明質酸鈉凝膠，在預防鼻內鏡術后術腔粘連和促進術后創傷愈合方面具有良好的療效，已在歐洲、美國及中國的臨床中得到了較好的應用[10,12]；該凝膠的性能也適合于IUA的預防。本研究擬基于文獻的報道方法建立兔IUA的動物模型[13]，評估醫用自交聯透明質酸鈉凝膠在動物體內用于宮腔粘連預防的安全性和有效性，同時也對該產品的宮腔粘連預防機理進行了探討；本研究將為醫用自交聯透明質酸鈉凝膠的IUA預防臨床應用提供相關的實驗依據。

1 研究方法

1.1 試驗材料

試驗產品(醫用自交聯透明質酸鈉凝膠)由常州百瑞吉生物醫藥有限公司提供，共分為兩個批次：在有效期內的批次和已過有效期的批次。試驗產品1：批號1110001；生產日期2011年10月25，有效期至2013年10月24日;試驗產品2：批號1404003；生產日期2015年04月15，有效期至2017年04月14日。脂多糖：購自Sigma公司，貨號L6529。戊巴比妥鈉：購自Solarbio公司，貨號P8410。

1.2 試驗動物及分組

成年健康雌性新西蘭大白兔 75只，體重 2.50-3.50 kg，常規條件飼養，標準飼料喂養，環境溫度和濕度分別保持在 18-22℃和 60%±20%。常規單籠飼養適應環境3天后隨機分為試驗A組、試驗B組和對照C組，每組25只。 試驗A組為：在行宮腔粘連造模后充填試驗產品1；試驗B組為：在行宮腔粘連造模后充填試驗產品2；對照C組為：僅行宮腔粘連造模。各組動物分組及體重情況見表1。

表1 分組及稱重情況表(Mean±SE)

各組動物的體重未見顯著性差異(P>0.05)。

1.3 試驗方法

按文獻方法制備兔子宮腔粘連動物模型[13]。試驗組及對照組兔術前12 h禁食水；采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥位固定；取腹壁下切口打開腹腔，暴露出子宮，隨機取一側子宮，于子宮中下1/3處做0.5 cm縱切口，用直徑4 mm子宮內膜刮勺刮取中上段子宮內膜，當子宮四壁粗糙時，停止刮宮，宮腔留置脂多糖棉線，棉線殘端留置于腹部，留長約3 cm尾絲，剪去多余棉線，試驗A和B組分別注入試驗產品1和2以充填滿整個術側宮腔(約0.3 ml)；2 d后輕拉尾絲，取出宮腔內棉線。對照C組不注入任何防粘連材料，直接縫合，2 d后輕拉尾絲，手術均由同一人完成。動物清醒后分籠飼養，每籠 1只。連續 3 d肌肉注射青霉素預防感染。標準飼料喂養，環境溫度和濕度分別保持在 18-22℃和 60%±20%。術后不同時間點進行存活率、血、尿等安全性實驗室檢查；并處死動物進行觀察試驗產品殘留量，收集子宮組織，進行子宮宮腔粘連情況的觀察評價；進行HE染色和馬松三色染色，進行子宮宮腔創傷愈合情況觀察評價(子宮組織內膜腺體數量和纖維化評價)。

1.4 檢測指標

1.4.1存活率 一般情況觀察3組兔子術后是否存活至試驗完成；如有死亡則記錄原因。

1.4.2試驗產品殘留量 各組于術后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d時處死5只動物，觀察宮腔內試驗產品的殘留量；大體觀察試驗產品在宮腔內的殘留情況。

1.4.3宮腔粘連情況 由于粘連需要5-7 d才能形成[6,7,14]，因此各組在術后7 d、14 d、21 d和28 d時分別對處死的5只動物檢查宮腔的粘連情況；評分標準見表2。該評分標準參考了AFS 1988的宮腔粘連評分系統[15]；但由于兔月經情況無法觀察，因而未包括月經功能項的評分，改為更為客觀的子宮的組織學檢查評價(膜腺體數量及纖維化情況評價，參見1.4.4)。

表2 宮腔粘連評分標準

注：無粘連時宮腔涉及范圍得分和粘連類型得分均為0分。

1.4.4子宮組織的膜腺體數量及纖維化情況 進行HE染色和馬松三色染色，觀察子宮組織的膜腺體數量及纖維化情況。兔子宮組織樣本的石蠟切片分別行HE染色和馬松三色染色。每張HE染色切片選取4個高倍鏡視野，計數每個視野下腺體數量，取其平均值。纖維化面積比率計算方法：每張馬松三色染色切片選取4個視野，纖維化面積比率為每個視野子宮內膜間質纖維化的總面積除以子宮內膜間質和腺體面積之和，取平均值，以圖像分析系統自動計算完成。

1.4.5實驗室檢查情況 術后3 d、28 d進行血常規、血生化、尿常規檢查。

2 結果

2.1 存活率

三組兔子按照前述實驗方法施行手術。各組動物經手術后生命體征平穩，自主活動能力稍恢復。每天兩次觀察，試驗A組、試驗B組及對照C組均未出現死亡及感染情況，存活率為100%。

2.2 試驗產品殘留量

后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d時各組分別處死5只動物以觀察宮腔內試驗產品的殘留量。經大體觀察，發現試驗產品1和2的殘留量基本相一致，均隨著時間逐漸降解消失；術后3 d時試驗產品均充滿整個術側宮腔，7 d時仍有較多試驗樣品充滿大部分術側宮腔(約75%宮腔體積)，至14 d時試驗樣品完全降解消失。

2.3 宮腔粘連情況

術后7 d、14 d、21 d和28 d分別檢查宮腔粘連情況并評分；粘連得分見下表3。術后7 d、14 d、21 d和28 d，試驗A組和B組的宮腔粘連得分均顯著低于對照C組(P<0.05)，即與對照C組相比，試驗產品1和2均顯著預防了宮腔粘連。與術后7 d相比，各組術后14 d時宮腔粘連得分有所降低，可能與后期炎癥反應及其引起的腫脹逐漸消退有關，大體上可能表現為粘連涉及范圍稍有減少；自術后14 d起始，粘連穩定形成，因此粘連得分趨于穩定。上述現象與粘連形成的機理及過程相一致[6,7,14]。

2.4 子宮組織內膜腺體數量及纖維化情況

術后各觀察時間點取兔子宮組織切片進行HE染色和馬松三色染色，觀察子宮組織的膜腺體數量及纖維化情況。

表3 各組宮腔粘連評分

正常子宮內膜間質微血管豐富；馬松染色鏡下觀察見黏膜、黏膜下層、血管和肌肉呈暗紅色；子宮內膜間質膠原纖維呈藍色，梭狀，排列較整齊。術后3 d，試驗A組、試驗B組和對照C組均在宮腔內偶有扁平上皮細胞再生，宮腔內出現大量纖維性滲出液以及壞死組織碎片；間質出血，水腫，淋巴細胞浸潤，部分區域纖維化，膠原纖維增加；部分毛細血管管腔閉鎖。術后7 d，對照C組宮腔部分閉鎖，縱行剖開，大體觀察可見一些較牢固纖維性粘連帶；鏡下可見纖維性粘連帶增厚，70%-80%未粘連區域覆蓋扁平上皮細胞，上皮層下可見極少量腺體；80%-90%間質區纖維化增生，膠原纖維聚集，間質毛細血管稀少。試驗A和B組的組織學形態基本相同；與對照C組相比，試驗A和B組鏡下纖維化面積均較對照C組減少，同時腺體比對照C組增多。

術后14 d至28 d時，各組的宮腔組織學形態與術后7 d時類似。對照C組術后28 d時子宮內膜形態學仍未恢復，宮腔瘢痕粘連化明顯；試驗A組和B組28 d子宮內膜形態基本恢復，宮腔基本無瘢痕粘連。

表4 術后7 d兔子宮內膜纖維化面積比率與腺體數量比較(Mean±SE)

試驗A組和B組的纖維化面積比率(%)和腺體數量相近(P>0.05)，均顯著優于對照C組(P<0.05)，即與對照C組相比，試驗產品1和2的使用均顯著減少了纖維化面積比率(%)和均顯著增加了腺體數量(表4)。

2.5 血尿生化指標檢測:術后3 d、28 d進行血常規、血生化、尿常規檢查；結果見表6-1至6-6，各組之間均不存在顯著差異(P>0.05)。

表6-1 術后3 d血常規

表6-2 術后3 d血生化

表6-3 術后3 d尿常規

表6-4 術后28 d血常規

表6-5 術后28 d血生化

表6-6 術后28 d尿常規

3 討論

組織粘連形成機制已經得到廣泛的研究，主要機制包括：組織損傷后即刻觸發了系列的級聯反應(血管通透性增加；釋放出組胺、激肽類等活性因子)；在3小時內產生成纖滲出物，并逐步沉積；正常情況下，成纖滲出物可在72小時內被清除；然而損傷降低了局部溶纖活性，因而不能快速分解清除成纖滲出物，從而形成了前期的纖維性粘連；隨后成纖細胞快速侵入并伴隨血管生成，形成了永久的含血運的組織疤痕粘連[6,7,14]。粘膜的愈合與皮膚的愈合不同，為自創傷底部起始的上皮化過程，因而愈合較快，粘膜上皮化的關鍵期限是5-7天，術后粘連預防的關鍵是在5-7天內物理隔離尚未完全上皮化的粘膜表面[6,7,14]。

在本動物試驗研究中，術后3天時觀察到了大量的纖維性滲出物，呈現出嚴重的急性炎癥反應；術后7天時，粘連已穩定形成，至術后14天起不再發生變化。試驗產品在宮腔內的停留時間約為7-14天，可在5-7天內的粘膜關鍵上皮化期限內較好地隔離尚未完全上皮化的粘膜表面，因而較好地預防了宮腔粘連。此外，透明質酸鈉具有的調控炎癥反應、促進創傷愈合的多重功能也可能通過促進粘膜上皮化的進程，從而達到更好預防宮腔粘連的功效[16]。