左旋精氨酸對eNOS在大鼠實驗性牙移動中表達影響的研究

李 慧,李 佳,汪 洋,李明賀

(1.首都醫科大學密云教學醫院 口腔科,北京101500；2.吉林大學口腔醫院 頜面外科,吉林 長春130041；3.吉林大學口腔醫院 正畸科，吉林 長春130041)

正畸的核心是牙移動[1]，實現牙移動則需要通過牙周組織的改建，包括血管改建和骨改建，而牙齒移動速度和正畸矯治療程便取決于牙周組織的改建水平。對其機制的研究以及方法的實現對口腔正畸臨床工作具有重要的意義。對此諸多學者做了大量的研究，發現適當的給藥、加入細胞因子以及物理方法的使用等將會促進牙周組織改建，即對正畸臨床提供加速牙移動的方法，但仍處于探索階段。以往有研究表明，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)參與正畸牙移動牙周組織改建[2]。本研究旨在通過建立大鼠實驗性牙移動模型，注射一氧化氮(nitric oxide，NO)前體左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)，觀察eNOS在牙周組織中的表達，研究在實驗性牙移動牙周組織的血管改建和骨改建中eNOS和NO如何發揮作用，從而進一步闡釋實驗性牙移動牙周組織改建的機制，并為L-Arg的相關臨床應用提供了實驗依據。目前對此尚未見有報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

取40只健康的6周齡雄性Wistar大鼠，體重為(0.15±0.02)kg，(由吉林大學動物實驗室提供)。隨機分為實驗組與對照組各20只，實驗組與對照組按文獻[3]描述建立實驗性牙移動動物模型(置NiTi螺簧于大鼠右上第一磨牙和上頜切牙之間，支抗牙為上頜切牙，拉右上頜第一磨牙以50 g的力，使其向近中移動)，加力后立即對實驗組大鼠用L-Arg(300 mg/kg/d[4]在0.5 ml生理鹽水中溶解)行腹腔注射，對照組用等量的生理鹽水注射，1次/天。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗eNOS多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組織化學SP試劑盒(福州邁新公司)；L-Arg(美國 Sigma 公司)；XL-I型正畸測力計(西北工業大學)。

1.3 標本制作

應用經1‰DEPCS水處理過的4%多聚甲醛在加力注射后的1、3、5、7、14天經心臟灌注分別處死兩組動物各4只。制作牙周組織和牙的聯合標本，經過固定過夜、脫鈣、脫水及石蠟包埋，制作5 μm厚的組織切片，其為近遠中方向、以右上頜第一磨牙為中心。常規HE染色作組織的定位參照片，以代替一抗的PBS作為陰性對照，行SP法免疫組織化學染色以eNOS為一抗(1∶200)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.4 鏡下觀察及圖像分析

1.4.1eNOS陽性反應灰度積分 在eNOS染色之后，隨機選取3張從每組標本的切片中，光鏡下對比觀察對照組與實驗組eNOS表達陽性區域的分布。隨機選5個非重疊視野(×200)從每張切片中以測定eNOS陽性反應強度灰度，轉化為灰度積分=陽性產物面積/測量面積×陽性強度灰度值。

1.4.2新生血管計數 按照文獻標準Weidner方法[5]，首先查找血管密集區于低倍鏡下，再將每個視野中的微血管數于高倍視野下(×200)計數：即微小血管由2-3個內皮細胞或內皮細胞簇構成，而以下情況均不計數：達8個紅細胞大小的血管，管腔帶有較厚肌層或由5個以上內皮細胞構成管腔。隨機選5個非重疊視野，測定值取平均值。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 光鏡觀察

2.1.1HE染色 實驗組與對照組相似，因機械牽拉牙周膜分為壓力側和張力側，壓力側牙周膜纖維排列紊亂；張力側牙周膜纖維排列具有方向性。而實驗組可見更為豐富的微血管。

2.1.2eNOS免疫組織化學染色 eNOS免疫組化染色呈棕黃色顆粒的為陽性表達，實驗組和對照組各時間點均有不同程度陽性表達，強度隨著時間呈一定的變化規律。對照組陽性強度普遍低于實驗組，實驗組在血管上皮細胞、破骨細胞及成骨細胞、成纖維細胞均有不同程度陽性表達。

1天組：

對照組：張力側牙周膜增寬，血管相對擴張。壓力側牙周膜變窄，血管部分受壓，管腔形態不規則或呈梭形。eNOS在部分血管內皮細胞中表達呈陽性(++)，骨細胞中未見明顯表達(±)，成纖維細胞表達呈弱陽性(+)。牙槽骨改建反應未見(圖1)。

圖1 對照1天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

實驗組：與對照組反應基本相似。牙骨質表面的成牙骨質細胞可見。

3天組：

對照組：張力側牙周膜明顯增寬，血管繼續擴張。壓力側牙周膜變得紊亂，血管腔隙甚至閉塞在狹窄部分(圖2)。eNOS在血管內皮細胞、成纖維細胞表達呈強陽性(+++)， 在成骨細胞中也有陽性表達(圖3)。

圖2 對照3天組牙周組織(HE,×100)

圖3 對照3天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

實驗組：較對照組新生血管數目多。可見到骨吸收后的骨陷窩，同時新骨在牙槽骨表面可見形成(圖4)。eNOS在血管內皮細胞、破骨細胞、成纖維細胞表達呈強陽性(+++)，與比對照組相比增強(圖5)。

圖4 實驗3天組牙周組織(HE,×100)

圖5 實驗3天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

5天組：

對照組：張力側血管擴張增生，成骨細胞成排排列， 新骨沉積于牙槽骨表面。壓力側可見新生的毛細血管，牙槽骨表面多個破骨細胞，骨吸收陷窩明顯，各類細胞eNOS表達均略有降低。

實驗組：形成更多新生的毛細血管，血管內皮細胞、破骨細胞等eNOS呈強陽性(+++)染色，與對照組相比明顯增高(圖6)。

圖6 實驗5天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

7天組：

對照組：張力側可見數目較多的成骨細胞，鑲邊樣或成排排列分布于新骨表面。血管擴張，新生血管大多分布于新生的牙槽骨周圍。壓力側可見較豐富的新生毛細血管，骨吸收明顯。各類細胞的eNOS表達強度都呈明顯降低(圖7)。

實驗組：張力側可見旺盛的新生血管，數目增多明顯；牙周膜較寬，牙槽骨可見增生反應明顯。壓力側可見豐富的新生血管，有較小的管腔；牙周膜較窄，牙槽骨表面可見吸收較明顯(圖8)。血管內皮細胞、破骨細胞、成纖維細胞的eNOS染色呈更強的陽性反應較對照組(圖9)。

圖7 對照7天組牙周組織eNOS的表達(SP,×100)

圖8 實驗7天組牙周組織(HE,×100)

圖9 實驗7天組牙周組織eNOS的表達，新生血管數目較多(SP,×100)

14天組：

對照組：張力側新生牙槽骨已連成片在某些區域，可見成骨細胞分布于其表面。牙槽骨內與牙周膜仍見較多的新生血管，大多靠近于新生的骨組織。壓力側牙周膜逐漸恢復寬度， 血管也恢復正常形態，破骨減弱(圖10)。血管內皮細胞、成纖維細胞eNOS呈弱陽性表達(+)。

實驗組：與對照組反應類似，可見較多的新生血管，血管內皮細胞、成骨細胞、成纖維細胞等eNOS表達呈弱陽性(+)。新生骨分布已成片，破骨活動少見。

圖10 對照14天組牙周組織(HE,×100)

2.2 圖像分析

2.2.1實驗性牙移動牙周組織中eNOS免疫組化染色的圖像分析 受力后第1天，實驗組與對照組牙周組織中eNOS表達無明顯差異，自第3天，實驗組高于對照組(P<0.05)。高峰均在牙齒受力后第3天出現。見表1。

表1 實驗組與對照組eNOS陽性反應平均灰度積分的比較

注：P<0.05有統計學意義

2.2.2實驗性牙移動牙周組織中的新生血管計數 正畸加力后的不同天數，實驗組與對照組新生血管數量的變化規律相似，均于受力后第7天出現高峰。在加力第3天-第7天時實驗組牙周組織新生血管計數高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 實驗組與對照組新生血管計數的比較 (個，

注：P<0.05有統計學意義

3 討論

加速正畸牙移動過程中的牙周組織改建才能加速正畸牙移動，研究牙周組織改建及牙移動的機理對正畸臨床有重要的實際意義。有研究顯示：實驗性牙移動與營養因素、藥物的使用等有關。如雌激素、雄激素可使實驗性牙移動減緩；而皮質激素和甲狀腺激素將使實驗性牙移動加快。L-ARG也是一種可利用的營養素，因其對局部缺血組織的再生和血管發生的有益的作用，目前在臨床上已應用于治療多種缺血性疾病，但有些方面仍在觀察研究之中。一氧化氮合酶的亞型有3種：內皮型(endothelial nitric oxide synthase,eNOS) 、神經元型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)[6]，NO是最重要的一種內皮源性血管活性因子，介導和調節多種病理生理反應，具有擴張血管、組織修復等作用，以L-Arg為底物，由NOS催化生成[7]。NO途徑也是一種重要的新血管形成的調節器。研究表明外源性L-Arg能增加血管NO生物活性，明顯促進NO合成[8]。而受力反應中NO的釋放主要由eNOS 催化產生。Nakago也發現NO增加出現在成纖維細胞受力后，且是eNOS促使NO增加，而不是iNOS。

本實驗結果顯示，在對照組和實驗組中eNOS都隨著時間呈一定的變化規律的表達。eNOS在血管上皮細胞、破骨細胞、成骨細胞和成纖維細胞均呈不同程度陽性表達。而且從第3天開始，eNOS表達實驗組高于對照組。說明對于實驗性牙移動的牙周組織改建這一過程eNOS參與其中，且L-Arg促進eNOS參與。分析機制可能為細胞因子如IL-1、VEGF等早期產生較少，則早期主要是由正畸牽引力誘使eNOS表達升高，之后伴隨細胞因子增加，如VEGF是eNOS和NO的上游調節[9]，以及持續的牽引力進一步升高eNOS的表達，兩組高峰均出現于第3天，之后因為產生的NO和活化的破骨細胞可能也反過來使eNOS的活性受到抑制，同時牽引力使牙齒向其方向移動，牽張力對牙周組織的刺激減小，部分細胞因子也開始減少，降低了eNOS的表達，eNOS在這個過程中將機械力轉變為生物化學信號，起了介導的作用。注射L-Arg后，eNOS的表達明顯增多，說明促進了eNOS在實驗性牙移動中的參與。

本實驗中實驗組和對照組血管的增殖和再生開始于加力1天，血管化反應高峰出現于7天時，在此之后降低。在加力第3天-第7天時實驗組新生血管計數高于對照組，說明在局部缺血環境中，血管形成增加與eNOS的過表達有關。這與Corbett等認為NOS 的表達可改善局部微循環，增加血流量的研究結果相似。而且eNOS影響血管形成和改建，其主要產生不分支的、大的血管[10]。

本實驗結果還顯示，實驗組和對照組中eNOS在牙根周圍牙槽骨表面破骨細胞、成骨細胞中均有表達，提示eNOS參與早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建。NOS和NO與骨代謝密切相關聯[11]，Zaman等研究表明在機械負荷作用下，骨細胞主要表達eNOS，而iNOS及nNOS幾乎不表達。在兔下頜骨骨折愈合中也有類似情況，通過調控NOS的表達，調節了成骨細胞的增殖、分化和礦化能力，導致骨代謝發生改變[12]。而且實驗組中eNOS在破骨細胞、成骨細胞中的表達較對照組明顯，破骨細胞活化也明顯，破骨活躍，成骨也被促進。提示注射NO前體L-Arg促進早期實驗性牙移動牙周組織的骨改建并促進eNOS參與這一過程。分析原因近年來發現NO是骨反應的重要媒介和信號分子，其參與調節破骨細胞、成骨細胞活性[13]及維持骨形態和進行骨改建，并在破骨細胞和成骨細胞的信號傳導進程中起重要作用[14]。如eNOS所合成的低濃度的NO可促進破骨細胞前體成熟，成骨細胞增殖，骨基質分泌功能增加，從而進行骨改建[15,16]。因此藥物和條件的改變可以引起局部 NO 濃度的變化，從而引起骨的重塑[17]。

綜上，L-Arg通過上調實驗性牙移動牙周組織中eNOS的表達，促進eNOS參與牙周組織改建，從而在促進牙周組織的血管改建與骨改建方面發揮了作用。