刺五加多糖對腫瘤干細胞的作用研究

陳靖昀,于書劍,肖 冬*

(1.延邊大學醫學院，吉林 延邊133002；2.吉林大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科,吉林 長春130021)

喉癌(laryngeal cancer，LC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，中國東北地區為喉癌高發區,喉癌治療主要以手術和放療為主，化療為輔。近年來隨著對腫瘤研究的不斷深入發現，具有有強的遷徙、浸潤和轉移能力和分化潛能腫瘤干細胞,是腫瘤發生發展的一個重要因素[1]。國內外研究者通過比較干細胞和腫瘤細胞發現兩者有驚人的相似之處：譬如同樣具有自我更新和分裂增殖能力，同樣有Notch、Wnt、Sonichedgehog(Shh)、PI3K/PTEN/AKT和Bm-i1等信號通路參與細胞的生長發育；具有遷移或轉移能力[2]。這些相似點暗示在腫瘤組織中可能存在一小部分非腫瘤細胞,與其它機體干細胞一樣具有自我更新和無限增殖的能力，而這一小部分細胞便是腫瘤干細胞。CD133是具有5個跨膜區的糖蛋白，有研究發現，在人喉癌細胞系Hep-2中有3.22%的微量細胞呈陽性表達[3]，Hep-2 CD133+陽性細胞在體外分化、增值能力及體外成瘤能力方面強于CD133-陰性細胞[4,5]，CD133可能是喉癌干細胞的標志之一。同時，在腦腫瘤[6]、非小細胞肺癌[7]、前列腺癌[8]及肝癌干細胞中都有CD133表達的報道[9]，目前越來越多的實驗證實CD133+細胞與腫瘤信號轉導、腫瘤的免疫逃逸、多藥耐藥現象和放療抵抗均有相關性，CD133+細胞可望成為喉癌干細胞治療的靶點[10]。

國內外對刺五加(Acanthopanax senticosus Harms)的藥理作用研究表明：刺五加中，其中提取的苷類、黃酮、多糖、和礦物質等活性成分具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射損傷及抗疲勞等[11-14]生物活性作用。而刺五加多糖(ASPS)已被證實具有抗衰老、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等功效，國內外研究顯示，其具體機制可能于調節免疫相關功能相關，通過提高淋巴細胞增殖活性，并增加血液中T淋巴細胞的的亞群含量，增強細胞毒T淋巴細胞的殺傷活性，促進多種細胞因子及干擾素的合成，來抑制腫瘤生長[15,16]，但是在抑制腫瘤生長的過程中發揮怎樣的免疫調節作用，具體機制尚不明確。

本實驗以體外研究喉癌干細胞作為對象，采用CCK-8法、基因測序分析法、Western blot 通過檢測刺五加多糖ASPS 對Bcl-2和PD-L1蛋白表達的影響，初步探討ASPS抑制喉癌干細胞生長的機制，為其臨床應用提供實驗理論基礎。

1 材料和方法

免疫磁珠法對喉癌Hep-2細胞分選，優化Hep-2中含有CD133陽性標志的干細胞比例，給予不同濃度的刺五加多糖ASPS，比較其細胞增殖、細胞周期實驗，通過Western Blot方法分析刺五加多糖ASPS作用喉癌干細胞作用的機制。

Hep-2細胞系由中國醫學科學院提供。Hep-2 細胞加入培養液 為含 10 %小牛血清、青霉素和鏈霉素各 100 U/ml 的RPMI1640 培養液中,置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

刺五加多糖ASPS購于陜西慈緣生物幾首有限公司(NO.CY180310)，細胞培養基1640購自美國Gibico公司， 胎牛血清購自 Hyclone 公司，免疫磁珠干細胞提取試劑盒購于stemcell公司，CCK-8購自東仁化學科技有限公司，凋亡流式檢測試劑盒購自美國BD公司。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、抗體購自abcam公司。

1.1 Hep-2 CD133陽性細胞分選

取對數期生長細胞，制成1 mL 108單細胞懸液，細胞懸液中添加100 μl FcR blocking和5 μl PE-conjugated CD133 antibody 靜置15 min，加入100 μl PE selection cocktail 混勻靜置 15 min，向懸液中加入50 μl 磁珠懸液Magnetic Nanopatricles 10min，將混勻后的細胞懸液置入磁極5 min，拿起磁極倒出懸液，加入PBS重新混勻細胞，重復放入磁極和倒出的步驟3次，收集CD133陽性細胞，并利用流式細胞術進行分選純度驗證。

1.2 干細胞腫瘤成球實驗

取對數生長期的Hep-2 CD133陽性細胞，分為對照及刺五加多糖ASPS5 μg/mL給藥組，以每孔1000個接種于超低吸附培養六孔板中，每2天更換成球實驗培養基(EGF 20 ng/mL， bFGF 10 ng/mL， B27 1%)，并觀察計數Hep-2 CD133的成球情況，培養14天，拍照，計算成球率，每組設3個重復對照，每孔計數3次，取平均值。

1.3 CCK-8法測定細胞對刺五加ASPS的敏感性

選取對數期Hep-2 CD133細胞，調整密度為5×104 ml-1，接種于96孔細胞，每孔接種于96孔板，每孔100 μl，再分別加入不同濃度的刺五加多糖ASPS培養72 h候，每孔加入10 μl CCK-8，孵育30 min后，測定OD值，并計算細胞抑制率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡的變化

分別收集對數生長期 Hep-2 和Hep-2 CD133陽性的細胞，胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度。置于恒溫 37℃，5%CO2，95%相對濕度的孵箱中培養 24 h 至細胞密度為80%。進行Annexin-V/PI 凋亡標記及檢測。

按 Annexin V-FITC Kit 試劑說明書試劑(細胞數≤106個為例，如果細胞數>106 試劑相應加倍)：加 1 ml 1×binding Buffer，300× g 離心 10 min，移去上清(此步驟可重復 1 次)；加入 100 μl 1×binding Buffer 重懸細胞；加 10 μl Annextin V-FITC，混勻后室溫下孵育 15 min；加 1 ml 1×binding Buffer，300× g離心 10 min，移去上清；加入 500 μl 1×binding Buffer重懸細胞.流式細胞儀檢測凋亡細胞率。

1.5 Western Blot

Wetserblot Blot 方法檢測給予刺五加多糖ASPS前后相關蛋白變化情況，用蛋白裂解液于冰上裂解 給予刺五加多糖ASPS前后的Hep-2 CD133 30 min，4℃ 12 000×g離心40 分鐘,取上清-80℃儲存備用,上清用 Bradford 法測定蛋白濃度,樣品 95℃變性5 min后,每孔上樣60 μg,SDS-PAGE(5%stacking gel,8% separating gel)電泳 80 伏2 小時轉膜于 PVDF 膜上,用 4%脫脂奶粉/TBST 室溫下封閉抗原 1.5 小時 。一抗用 4%脫脂奶粉/TBST 稀釋后 4℃孵育 PVDF 膜過夜。TBST 洗膜三次,每次10 min 然后加入二抗,室溫下搖床孵育 1小時,再次 TBST 洗膜三次,每次10 min。ECL 曝光顯影。圖像分析儀定量分析表達蛋白的光密度。

1.6 統計分析

應用Spss17.0統計軟件進行數據處理，數據提供形式為平均值±標準差，比較采用獨立樣本t檢驗分析，P<0.05 位有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 喉癌Hep-2 干細胞分離

Hep-2細胞CD133的表達率如圖， 可以看出分選前CD133 在hep-2細胞的含量為3.8%，免疫磁珠法兩次分選后，CD133 陽性表達率最終為84.5%，免疫磁珠法分選效率較高。

圖1 喉癌Hep-2細胞中CD133細胞的分離

2.2 腫瘤成球實驗

EGF 20 ng/mL， bFGF 10 ng/mL，B27 1%培養14天后，分別觀察并計數兩組細胞的成球率，Hep-2 CD133組的成球率為69.33%±2.96%，刺五加100 μmol/L ASPS給藥組的成球率為 49.67%±4.18%，兩組統計學比較，差異具有統計學意義P<0.05，說明刺五加ASPS可以明顯抑制腫瘤干細胞的成球率。

圖2 干細胞成瘤實驗結果

2.3 CCK-8 實驗結果

在超凈臺中將 96 孔板中培養基換為不含血清及抗生素的 1640 培養基100 μl，然后加入 CCK-8 試劑 10 μl；在 96 孔板中選擇未使用的空加不含血清及抗生素的 1640 培養基 100 μl及 CCK-8 試劑 10 μl作為空白組，37℃度孵育2 h；測值：在酶標儀 450 nm 處檢測吸光度(A)值，計算細胞生存率。細胞生存率=(實驗組 A 值-空白組 A 值)/(空白對照組 A 值-空白組 A 值)×100%。

結果可以看出隨著時間及刺五加多糖劑量的不斷增加，刺五加多糖ASPS對Hep-2及Hep-2 CD133陽性細胞有明顯抑制作用，其中100 mg/L劑量的ASPS對兩種細胞抑制作用最明顯。

圖3 CCK8 檢測刺五加作用喉癌CD133干細胞細胞的活性變化

2.4 刺五加對Hep-2細胞和Hep-2 CD133細胞凋亡

不同濃度刺五加多糖作用Hep-2 和Hep-2 CD133凋亡流式結果如圖5所示，可以看出隨著刺五加多糖濃度的增加，Hep-2及Hep-2 CD133細胞凋亡率不斷增加，并且Hep-2 CD133細胞對100 mg /L的刺五加多糖敏感性更高，凋亡細胞數明顯高于Hep-2，說明Hep-2 CD133細胞對刺五加多糖更敏感。

圖4 CCK 8 檢測刺五加作用喉癌Hep-2細胞的活性變化

2.5 Western Blot

Western Blot實驗結果顯示，給予100 mg/L的刺五加多糖后Hep-2 CD133中的PD-L1和Bcl2表達程度較之前有明顯降低的趨勢(P<0.05)，說明刺五加多糖有抑制促癌基因Bcl2和細胞程式死亡配體PD-L1表達的作用，其發揮抑制Hep-2 CD133細胞的作用可能與抑制Bcl2和PD-L1相關。

3 討論

喉癌是頭頸部腫瘤中的惡性腫瘤之一，目前對喉癌主要采用手術結合放化療的綜合治療方法，其中，目前許多個觀點認為，頭頸腫瘤的惡性病變與腫瘤干細胞密切相關。

腫瘤干細胞(CSCs)是一類具有自我更新、分化和致瘤能力的癌細胞亞群[17]，在維持腫瘤惡性增殖、侵襲、轉移和復發等方面起著決定性作用[18,19]。目前，喉癌干細胞標記物的研究仍處于起步階段，CD133 是一種跨膜糖蛋白，在造血干細胞、內皮祖細胞及一些正常組織的干細胞中普遍表達，是多種腫瘤的干細胞標記物[20]，有研究表明，CD133 存在于頭頸腫瘤中，并且與頭頸腫瘤的侵襲、轉移、放化療耐受密切相關[3,21,22]。MACS(免疫磁珠分選技術)是一種高度特異性的細胞分離技術，目前已經廣泛應用于癌癥研究、免疫學及干細胞研究中，與流式等其他分選細胞技術相比，MACS 是一個相對簡單、效果好并且節約成本的方法，同時，MACS 對細胞損傷小，可以很好的保持細胞活力，本實驗中，我們通過免疫磁珠分選技術分選出CD133陽性干細胞，并利用流式細胞儀檢測分選后 CD133的表達，提示MACS能有效富集干細胞。

圖5 流式細胞方法檢測刺五加ASPS對兩種細胞的促進凋亡作用

圖6 刺五加多糖對Hep-2 CD133中 Bcl2和PD-L1的表達作用影響

PD-1/PD-L1免疫信號通路發揮多種生理功能，在T細胞參與的免疫應答中，向T細胞傳遞抑制性信號，同時PD-1偶聯受體可以抑制PI3K/AKT和Ras/MEK/Erk通路，與腫瘤細胞上的PD-L1共同作用從而抑制B細胞活化誘導T細胞耗竭，減弱機體的免疫功能，阻斷腫瘤負調控PD-1/PD-L1結合可增強抗腫瘤免疫能力，從而控制腫瘤的發展，重塑集體對腫瘤的免疫應答功能[23,24]。因此，作用于抗PD-1和抗PD-L1抗體靶點，從而阻斷PD-1/PD-L1信號通路的免疫治療的藥物在腫瘤治療中已取得廣泛認可。同時，Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中有著重要的調控作用。

本實驗采用免疫磁珠分選技術，以喉癌干細胞標記物 CD133為標記篩選 Hep-2中的干細胞，通過流式細胞術及相關蛋白表達分析，刺五加多糖ASPS具有抑制喉癌干細胞增殖的作用，其作用機制可能與刺五加多糖ASPS通過影響PD-L1和Bcl-2表達水平 促進干細胞細胞凋亡，從而抑制CD133干細胞的增殖，但具體機制需要進一步驗證。