皮油沉香基本特征及品質分析△

馮劍，劉培衛，楊云，歐陽冬青，劉洋洋，2*，魏建和，2*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室，海南 海口 570311；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所/中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193

沉香為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria和擬沉香屬Gyrinops植物的含有樹脂的木材，是名貴藥材和香料[1-2]。晉代《南方草木狀》[3]及唐代《新修本草》[4]均記載：“蜜香、沉香、雞骨香、黃熟香、棧香、青桂香、馬蹄香、雞舌香，按此八物，同出一樹也……其根、干、枝、節各有別色也。細枝緊實未爛者，為青桂香”。青桂香即為樹枝(青色樹皮)形成的沉香。不同部位結香種類可分為“四名十二狀”，青桂香屬于生結沉香，稱其為皮油”。

沉香一般是在莖、根、枝的木質部中形成，樹皮很薄，占比不大，易干枯或腐爛，很少形成沉香，因此，皮油現存量很少，一般認為一旦形成其品質較好，比較獨特。目前僅有對海南產皮油沉香揮發性成分進行了GC-MS初步分析，發現含倍半萜成分較多[5]，但國內外對皮油沉香結構、物種基原、品質評價等方面的科學研究未見報道。因此，本文從皮油沉香形態特征、顯微結構、物種基原及化學成分進行分析，旨在科學的認識和利用皮油沉香，為其鑒定和品質評價提供技術支撐。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

本實驗的材料是從市場上收集到典型的皮油沉香樣品(PC01、PC02、PC03)3份，以通體香沉香TC01(通體結香技術生產)1份和板頭香沉香BC01(全斷桿法生產)1份作為對照(圖1)。經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所劉洋洋副研究員鑒定，均為含有樹脂的沉香木材，憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標本館。

圖1 實驗用沉香樣品

1.2 儀器

PCR儀(Bio-Rad，美國)；核酸定量分析儀(Nanodrop 2000，美國Thermo)；臺式高速冷凍離心機(MIKRO 220R，德國 Hettich)；凝膠成像儀(SC910，杭州得聚儀器設備有限公司)；電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)；氣相色譜質譜聯用儀(7890A-5975C，美國 Agilent)；高效液相色譜儀(1525，美國Waters)；生物顯微鏡(Eclipse，日本NiKon)；電子天平(LE104E，瑞士Mettler Toledo)；超聲波清洗儀(PS-40，深圳市潔威超聲波)；HP-5MS% Phenyl Silox(30 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細管。

1.3 試劑

HP Plant DNA Kit(50)試劑盒(OMEGA)；引物(華大基因)；2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(Trans Gen)；瓊脂糖(Biowest agarose)；Marker D2000(中科瑞泰)；沉香對照藥材(121222-201203)和沉香四醇對照品(111980-201601，純度96.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為HPLC級，異丙醇、β-巰基乙醇為優質級，乙醚、無水乙醇和95%乙醇等均為分析級。

2 方法

2.1 感官評價方法

對收集的皮油沉香樣品，從外觀形態(形狀、斷面、皮部特征)、色澤、油性、氣味及樹脂(醇溶性浸出物)含量等方面進行評價。

2.2 顯微結構觀察

取沉香樣品切成方塊狀，置于包埋盒中，水浴煮至柔軟，經軟化、切片和透明，采用徒手滑走切片，再經水合氯醛溶劑透化后，在生物顯微鏡下觀察樣品切面結構。

2.3 物種鑒定

2.3.1 DNA提取 取沉香干燥樣品，刮去表面的雜質，用75%的酒精棉球擦拭樣品表面，晾干后用無菌刀片切碎樣品，稱取0.10 g，放置在2 mL的離心管中，充入液氮，高通量組織研磨儀中研磨2 min。用改良的OMEGA HP plant DNA提取試劑盒提取DNA，加入1000 μL預熱的CPL和10 μL的β-巰基乙醇，溫浴，其余步驟按照試劑盒說明書操作。測定總DNA的濃度，并計算OD260與OD280的比例，并將提取的DNA保存于-20 ℃冰箱，備用。

2.3.2 PCR擴增和電泳檢測 PCR體系總體積為25 μL，其中包含：2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(+dye)12.5 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL，dd H2O 8.5 μL。引物采用通用引物ITS2(ITS2-F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT)。PCR儀擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍照記錄分析。

2.3.3 PCR產物測序及序列數據分析 PCR產物直接使用測序儀進行雙向測序，序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.7.1 對測序峰圖進行拼接，去除引物區及低質量序列；基于隱馬爾科夫模型(HMMs)，去除5.8 s和26 s區域獲得ITS2序列。從GenBank數據庫中搜集并下載沉香屬ITS2序列，整合處理后結合樣品序列，進行二級結構的比較，并建立NJ和MP系統發育樹，分析沉香與其同屬沉香的親緣關系。

2.4 化學成分分析

2.4.1 揮發性成分分析

2.4.1.1 樣品制備 取0.20 g沉香樣品粉末加入乙醚溶劑超聲提取3次(5 mL/次)，每次超聲15 min，靜置5 min后0.22 μm過濾得到乙醚提取液，合并濾液，自然揮干后得到5份沉香樣品的油狀提取物(提取得率分別16.5%、4.0%、11.8%、10.2%、8.2%)，氣味芳香，香味獨特、濃郁。加乙醚溶解后GC-MS進樣分析。

2.4.1.2 色譜條件 1)色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱(5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm，0.25 μm)；2)升溫程序：柱溫50 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1升溫至140 ℃并保持1 min，然后以1 ℃·min-1升至160 ℃并保持2 min，最后以15 ℃·min-1升至250 ℃，進樣口溫度240 ℃；3)載氣為高純He，載氣(He)流速1.0 mL·min-1，進樣量1 μL；4)分流比20∶1，溶劑延遲時間4 min；5)電子轟擊(EI)離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度260 ℃，質量掃描范圍40～300m/z。

2.4.1.3 化合物鑒定 樣品經GC-MS分析后，通過MSD化學工作站，結合NIST11質譜圖庫對各組分質譜數據進行檢索與定性，并按峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

2.4.2 沉香特征圖譜及沉香四醇含量測定

2.4.2.1 樣品制備 取沉香四醇對照品，精密稱定，用95%乙醇溶解制成60 μg·mL-1溶液。精密稱定沉香樣品粉末0.20 g，置具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 95%乙醇，稱定質量，浸泡0.5 h，超聲處理1 h，放冷后稱定質量，用95%乙醇補足減失質量，搖勻，靜置，取上清濾液，即得。

2.4.2.2 色譜條件 參照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)方法，選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫條件。流速0.7 mL，柱溫30 ℃，檢測波長為252 nm[6]。

(2)粉煤灰吹填施工。相較于其他的填土材料，粉煤灰有著超強的透水性。使用這種材料能夠降低填土費用，并且利用其超強的透水性能夠加速吹填土的凝固。具體應用時要將粉煤灰和淤泥根據一定比例混合吹填，保證均勻吹填，從而改善土層固結特性。

3 結果與分析

3.1 沉香樣品感官特征

皮油沉香市場現存量低，對市場上購置的3批典型皮油沉香(PC01、PC02和PC03)進行感官特征評價，并以通體香沉香(TC01)和板頭香沉香(BC01)作為對比(表1)。皮油沉香外觀形狀多呈不規則的片塊，纖維多，外皮可見角質化的皮組織，內皮層色澤較深可見棕色樹脂，質地柔軟或較硬，具有清涼或甜蜜香味，醇溶性浸出物含量符合《中國藥典》規定。

表1 沉香樣品感官特征

注：—表示產地不明確。

3.2 沉香顯微結構

3批皮油沉香樣品顯微結構顯示(圖2)，皮油沉香PC01與通體香沉香TC01、板頭香沉香BC01樣品橫向切面(A1、A4、A5)具有典型的木間韌皮部、射線和導管等沉香顯微結構，徑向切面(B1、B4、B5)及切向切面(C1、C4、C5)也可以觀察到明顯的射線和導管。但皮油沉香PC02、PC03樣品的橫向切面、徑向切面顯微結構明顯不同于典型的沉香特征結構，韌皮纖維發達，射線多呈束，壁稍厚，不規則排列，木間韌皮部與射線交聯，呈棕色至棕黃色。韌皮薄壁細胞多成不規則，細胞徑向延長，部分被纖維隔斷成不規則。射線寬1至多列細胞，充滿樹脂。

注：A、B及C分別為橫向切面、徑向面和切向切面；1～3為3批皮油沉香樣品；4為通體香沉香；5為板頭香沉香；P為韌皮部；IP為木間韌皮部；XR為射線；V為導管。圖2 沉香樣品顯微結構

3.3 沉香樣品物種鑒定

對5批沉香樣品進行DNA提取，PCR擴增產物凝膠電泳圖見圖3。經去除5.8 s和26 s區域獲得ITS2片段序列的實際長度為230 bp，3批皮油沉香樣品的GC質量分數分別為57.39%、57.83%和57.83%，與GenBank數據庫的沉香屬AquilariaLam.物種的ITS2序列進行比對，進行ITS2二級結構預測及比對(Schultz et al.，2006)，3批皮油沉香樣品的二級結構見圖4所示，ITS2 二級結構與白木香Aquilariasinensi(Lour.)Gilg(GI238696002)一致，E-value為4.875 285 235 088 5e-119，ITS2二級結構均含有螺旋(Helix)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ。其中，螺旋Ⅱ結構最穩定，包含有CCGU和UGG的圖案結構。ITS2序列NJ和MP聚類樹拓撲構型基本一致(圖5、圖6)，Bootstrap重復1000次，枝上數值顯示自展率為≥50%。在構建的NJ和MP聚類樹中3批皮油沉香、通體香沉香和板頭香沉香樣品均與A.sinensis聚成一支，自展支持率分別為84%和86%。由NJ樹和MP樹可以明確3批皮油沉香樣品的基原為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg。此外，對物種進行種內種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離分析表明，皮油沉香樣品與A.sinensis的遺傳距離最近。

圖3 沉香樣品PCR擴增電泳圖

圖4 皮油沉香ITS2二級結構

圖5 基于ITS2序列構建的沉香樣品NJ樹

圖6 基于ITS2序列構建的沉香樣品MP樹

3.4 沉香GC-MS成分分析

不同沉香樣品乙醚提取物GC-MS總離子流圖有明顯差異，見圖7。3批皮油沉香樣品的乙醚萃取物檢測到倍半萜類成分分別為36、27和29；通體香沉香和板頭香沉香的乙醚提取物中倍半萜類成分為22和30種。對35種倍半萜類化合物和5種特殊的芳香族化合物進行比對分析(表2)。其中皮油沉香與通體香沉香、板頭香沉香樣品中共有的成分為芐基丙酮(4-phenyl-2-butanone)、α-檀香醇(α-santalol)、沉香螺旋醇(agarospirol)。其中，沉香螺旋醇為沉香的特征性成分，已有文獻報道[11]。此外，3批皮油沉香樣品間的化學成分差異也較大，皮油沉香與通體香沉香和板頭香沉香的氣味有所差異，也可能是含有這些特殊的成分所致。

注：A、B、C為3批皮油沉香；D為通體香沉香；E為板頭香沉香。 圖7 沉香樣品乙醚提取物GC-MS總離子流圖

表2 沉香樣品揮發性成分及其相對質量分數

注：—表示未檢出。

3.5 沉香特征圖譜及沉香四醇含量

3批皮油沉香的特征圖譜均與通體香沉香和板頭香沉香呈現的6個特征峰與《中國藥典》規定的一致，且峰1為沉香四醇(圖8)。PC01、PC02、PC03、TC01和BC01的沉香四醇質量分數分別為75.937(0.38%)、44.398(0.22%)、374.176(1.87%)、125.561(0.62%)、63.567 μg·mL-1(0.32%)。3批皮油沉香樣品沉香四醇含量均符合《中國藥典》規定的含量限值不得低于0.1%，其中皮油沉香PC03的含量最高。

4 結論與討論

4.1 皮油沉香基本特征及定義

皮油沉香外觀較為特殊，目前皮油沉香市場現存量極低，在野外也不易獲取，有學者認為皮油沉香是指白木香樹皮受傷，汁液泛出，在樹皮處所結的沉香[5]。針對皮油沉香并未有明確的定義，本研究從市場上收集了3批較為典型的皮油沉香樣品，經DNA條形碼鑒定基原為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.，同時對其進行了外觀形態形征及微觀結構初步描述。皮油沉香外觀形狀多呈不規則的片塊，外皮可見角質化的皮組織斑塊，內皮層色澤較深可見棕色樹脂斑點或條帶，纖維多，多呈棕黃色(圖9)，質地柔軟或較硬，一般具有清涼或甜蜜花香味。市場上也有常見的火燒樹的方法形成的薄片狀的沉香，結香面在內側，易與皮油沉香相混淆。3批皮油沉香樣品中，只有1批符合典型的沉香特征結構，2批皮油沉香樣品的橫向切面、徑向切面顯微結構明顯不同于典型的沉香特征結構，但皮油沉香顯微結構特點為韌皮纖維發達，射線多呈束，壁稍厚，不規則排列，木間韌皮部與射線交聯，呈棕色至金黃色。韌皮薄壁細胞多成不規則，細胞徑向延長，部分被纖維隔斷成不規則。射線寬1至多列細胞，充滿樹脂。

注：A為中檢院沉香對照藥材；B、C、D為3批皮油沉香；E為通體香沉香；F為板頭香沉香。圖8 沉香樣品HPLC特征圖譜

因此，結合皮油沉香的宏觀形態和微觀顯微結構，課題組提出了皮油沉香的定義，可供業內參考：皮油沉香(agarwood‘bark’)為瑞香科沉香屬植物樹皮至形成層之間的組織(有些也包含了部分木質部組織)，受到外界因素的傷害形成的含有樹脂的木材。外側具有明顯的角質化皮組織斑塊，內側色澤較深可見棕色樹脂斑點或條帶，斷面纖維眾多。

圖9 皮油沉香樣品宏觀結構

4.2 皮油沉香化學成分與品質特征

此外，皮油沉香與通體香沉香和板頭香沉香的氣味有所差異，可能是含有特殊的芳香族成分引起，皮油沉香PC01樣品中含有似松木樹脂及溫和木香氣味的異松油烯，也含有可作為定香劑的成分氫化肉桂酸，皮油沉香PC02樣品中含有具有玫瑰花香的芐丁醚，皮油沉香PC03樣品中含有具芳香氣味的對二甲苯，這些成分可使皮油沉香，具有香氣清涼，散發花香、蜜香氣味。