康復(fù)新液抗念珠菌性陰道炎的藥效研究△

楊亞超，蘇劉艷，劉一丹，莊馨瑛，王睿睿，張祎*

1.云南中醫(yī)藥大學 中藥學院，云南 昆明 650500；2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實驗室，云南 昆明 650500；3.昆明制藥集團股份有限公司，云南 昆明 650500

真菌感染性疾病，尤其是淺部真菌感染，在我國屬于常見病、多發(fā)病。其中念珠菌性陰道炎是一種常見的生殖道感染性疾病，其感染率可達11.8%。念珠菌性陰道炎，又稱霉菌性陰道炎，其致病菌以白色念珠菌Candidaalbicans為主，占比多達80%～90%。白色念珠菌廣泛存在于自然界中，其為條件致病菌，存在于正常人的皮膚、口腔及陰道中，但并不致病；當機體免疫力下降時，該菌就會大量繁殖并侵襲機體繼而誘發(fā)系列疾病。近些年來，由于抗菌藥的不規(guī)范使用[1]和激素、免疫抑制劑在臨床上的大量應(yīng)用[2]，導致機體菌群失調(diào)和免疫力降低，皮膚、黏膜、內(nèi)臟等發(fā)生真菌感染的概率大幅增高，念珠菌性陰道炎的發(fā)病率也居高不下。

中醫(yī)認為，念珠菌性陰道炎多因濕熱生蟲、蟲蝕陰中所致，屬外感濕濁穢毒之邪。其主要病因是脾氣之虛、肝氣之郁、濕氣之浸、熱氣之逼、帶脈之傷所致。此外，尚可因攝生不慎、洗浴用具不潔感染濕毒，直犯陰器，侵于任帶二脈，致任脈不固，帶脈失約，穢液下流而發(fā)。美洲大蠊為昆蟲綱翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，在我國分布廣泛，入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3]，其功效為散瘀消結(jié)、解毒利尿，臨床常外用治療蛇蟲咬傷、癰瘡腫毒、腳氣水腫、氣喘、小便淋濁等癥。生物學家發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊進化史漫長，繁殖能力強，生活環(huán)境較為復(fù)雜，攜帶50多種致病或非致病菌，但自身卻不被感染，說明其具有較強的抗菌性[4]。康復(fù)新液是美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物，有學者對其成分進行了分析，鑒定了十余個化合物[5]，發(fā)現(xiàn)其含氮化合物具有促創(chuàng)面愈合的活性[6]。有文獻報道康復(fù)新液具有廣譜抑菌、促細胞生長、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、增強免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等作用[7]。

本研究擬通過體外實驗檢測康復(fù)新液對白色念珠菌的抗菌作用，通過復(fù)制念珠菌性陰道炎小鼠模型，進行康復(fù)新液抗念珠菌性陰道炎的初步藥效學研究；以期為臨床提供治療念珠菌性陰道炎的候選藥物，同時為開發(fā)利用美洲大蠊藥用資源提供新的思路。

1 材料

1.1 藥物

康復(fù)新液購自昆明賽諾制藥股份有限公司，批號：17033022。氟康唑分散片購自南昌弘益藥業(yè)有限公司，批號：171128。

1.2 供試菌種

白色念珠菌標準株ATCC10231購自中國科學院昆明植物研究所；23#臨床耐藥株由昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科主任李玉葉教授贈送(由艾滋病患者體內(nèi)提取分離培養(yǎng)，對唑類抗真菌藥具有較強的耐藥性)。供試菌種使用前接種到沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

1.3 動物

SPF級雌性Balb/c小鼠120只，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，動物合格證號：SCXK(滇)K2015-0002，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物實驗室。

1.4 主要儀器與試劑

連續(xù)波長酶標儀(SPECTRAMAX PLUS384型，Molecular Devices美谷分子儀器有限公司)，生物顯微鏡(E200MV型，南京尼康江南光學儀器有限公司)，恒溫恒濕真菌培養(yǎng)箱(HWS-250BX型，天津市泰斯特儀器有限公司)。苯甲酸雌二醇(E2，江西博萊大藥廠有限公司，批號：20180820，規(guī)格：1 mL∶1 mg)，環(huán)磷酰胺(CAYMAN CHEMICAL COMPANY，批號：0491131-9，規(guī)格：10 g)，沙氏瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1073561，規(guī)格：250 g)，沙氏液體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：1069251，規(guī)格：250 g)，YPD瓊脂培養(yǎng)基，無菌PBS(Phosphate Buffered Saline)，gibco[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，生產(chǎn)批號：8117302，規(guī)格：500 mL]。

2 方法

2.1 康復(fù)新液抗白色念珠菌體外實驗研究

采用微量稀釋法，選用標準株ATCC10231和23#臨床耐藥株。實驗前用沙氏液體培養(yǎng)基將供試菌種密度調(diào)為1×105個/mL。用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋康復(fù)新液原液，陽性藥物氟康唑稀釋成初質(zhì)量濃度為1000 μg·mL-1，采用5倍倍比稀釋6個濃度梯度的方式制備不同濃度的藥物受試液。96孔板中依次加入100 μL不同濃度藥液和100 μL菌懸液，并混合均勻。同時設(shè)定陽性對照組(只加培養(yǎng)液和菌液)、空白對照組(只加培養(yǎng)液不加菌液)及陽性藥物對照組，臨床用藥以氟康唑最為廣泛，且效果最佳，因此選用氟康唑為本實驗陽性對照藥物。每組重復(fù)3個復(fù)孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，全自動酶標儀檢測625 nm波長處的吸光度(A)值，重復(fù)讀取3次取平均值。按公式(1)(2)計算白色念珠菌的半數(shù)有效濃度EC50值，以此判斷康復(fù)新液的抗菌抑菌作用。

(1)

半數(shù)抑菌濃度(EC50)=10[lg(c)+(a-50)/(a-b)×lg(1/5)]

(2)

式中：c為抑菌率大于50%對應(yīng)上述梯度濃度中的最小濃度，a為c對應(yīng)的抑菌率，b為僅小于a的抑菌率。

2.2 康復(fù)新液抗念珠菌性陰道炎實驗研究

2.2.1 動物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)表法分為4組，每組30只，分別為對照組、真菌感染模型組、康復(fù)新液治療組、氟康唑治療組。實驗前每只小鼠用無菌PBS陰道灌洗并將灌洗液進行培養(yǎng)，選擇灌洗液培養(yǎng)皿中無白色念珠菌生長的小鼠用于正式實驗。

2.2.2 模型復(fù)制及給藥 參考夏德超等[8]和孔小鋒等[9]模型復(fù)制方法并進行適度改良后建立白色念珠菌陰道感染小鼠模型。1)預(yù)處理：接種前4 d開始每鼠分別皮下注射E2(1 mg·mL-1)0.025 mL，1次/d，連續(xù)注射4 d，造成小鼠假發(fā)情，陰道擴張，之后每2 d注射1次，直至實驗結(jié)束；接種前3 d開始每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(100 mg·kg-1)10 mL·kg-1，1次/d，連續(xù)注射3 d，造成小鼠自身免疫缺陷，之后每3 d注射1次(75 mg·kg-1)10 mL·kg-1，直至實驗結(jié)束。2)真菌接種：陰道接種前用無菌PBS將白色念珠菌標準株密度調(diào)為2.5×107個/mL，用微量加樣器吸取菌懸液20 μL，注入模型組和治療組小鼠的陰道內(nèi)，原位停留1～2 min，防止菌液溢出；空白對照組陰道內(nèi)注入20 μL無菌PBS。接種后的第2天、第4天和第7天，每組取3只小鼠用無菌PBS陰道灌洗，將灌洗液進行培養(yǎng)，評價念珠菌性陰道炎動物模型是否成功。3)給藥：模型成功建立24 h后，康復(fù)新液治療組陰道灌洗給予相應(yīng)藥液100 μL/只，氟康唑治療組灌胃給藥(2 mg·kg-1)，同時陰道灌洗無菌PBS 100 μL/只，對照組、模型組陰道灌洗無菌PBS 100 μL/只，連續(xù)給藥7 d，每天按照檢測指標評價抗菌活性。

2.2.3 指標檢測

2.2.3.1 全身及陰道局部情況觀察 每個灌洗日進行全身情況觀察，記錄小鼠體質(zhì)量，并做陰道局部癥狀評分。評分標準為0分：外陰陰道無紅腫及分泌物增多；1分：外陰陰道輕微紅腫，無分泌物增多；2分：外陰陰道明顯紅腫伴分泌物增多；3分：外陰陰道明顯紅腫，出現(xiàn)潰瘍，并伴分泌物增多；4分：死亡。

2.2.3.2 灌洗液鏡檢及菌落培養(yǎng)計數(shù) 每個灌洗日陰道用100 μL無菌PBS灌洗，灌洗液置于潔凈無菌的EP管中，取10 μL灌洗液鏡下觀察菌絲生成情況；灌洗液用無菌PBS稀釋10倍，取10 μL接種于YPD瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，進行菌落觀察并計數(shù)(Colony-Forming Units，CFU，即菌落形成單位，以個/mL為單位計數(shù))。

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 康復(fù)新液體外對白色念珠菌的影響

按照2.1方法計算康復(fù)新液的半數(shù)有效濃度(EC50)值，以此判斷康復(fù)新液的抗菌作用。實驗結(jié)果表明，康復(fù)新液對白色念珠菌標準株有一定的抑制效果，半數(shù)有效濃度大約為康復(fù)新液原液2倍稀釋濃度；康復(fù)新液對臨床耐藥株的抑制效果較好，半數(shù)有效濃度大約為康復(fù)新液原液6倍稀釋濃度。陽性藥物氟康唑?qū)Π咨钪榫鷺藴手暧辛己玫囊种菩Ч珽C50為30.69 μg·mL-1；氟康唑?qū)εR床耐藥株的EC50大于1000 μg·mL-1，無抑制效果，具體結(jié)果見表1。

表1 康復(fù)新液體外對白色念珠菌的抑制作用

3.2 康復(fù)新液抗念珠菌性陰道炎實驗

3.2.1 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠一般情況的影響 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，真菌感染模型組小鼠行動呆滯、體表毛發(fā)均有脫毛嗆毛現(xiàn)象；與真菌感染模型組相比，康復(fù)新液、氟康唑治療組小鼠行動敏捷、毛發(fā)光滑、無脫毛嗆毛現(xiàn)象，具體結(jié)果見圖1。

3.2.2 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠體質(zhì)量的影響 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，真菌感染模型組小鼠體質(zhì)量整體呈下降趨勢，造模第13天、第14天體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)；與真菌感染模型組相比，康復(fù)新液治療組小鼠給藥第5天、第6天、第7天體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)，氟康唑治療組小鼠給藥第3天、第5天、第6天、第7天體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)，具體結(jié)果見圖2。

3.2.3 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠外陰外觀及陰道局部炎癥的影響 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，真菌感染模型組小鼠接種白色念珠菌后第2天開始外陰紅腫明顯、分泌物明顯增多，且在接種后第2天、第4天、第7～14天陰道炎癥評分顯著上升(P<0.01)；與真菌感染模型組相比，康復(fù)新液、氟康唑治療組小鼠給藥第5、6、7天外陰紅腫緩解、分泌物減少、陰道局部炎癥評分下降(P<0.01)，具體結(jié)果見圖3～4。

3.2.4 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠陰道菌落的影響 實驗結(jié)果表明，與對照組相比，真菌感染模型組小鼠陰道白色念珠菌定植菌落數(shù)顯著增多(P<0.01)；康復(fù)新液、氟康唑治療組與真菌感染模型組相比，小鼠陰道內(nèi)白色念珠菌定植明顯減少，灌洗液培養(yǎng)菌落數(shù)明顯減少(P<0.01)，具體結(jié)果見圖5～6。

圖1 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠一般情況的影響

注：與對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖2 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠體質(zhì)量的影響

圖3 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠外陰外觀的影響

注：各時間點部分分組內(nèi)3只小鼠陰道炎癥評分相同，故統(tǒng)計學標準差為0；第0天各組炎癥評分均為0，第2天、第12天、第13天、第14天對照組炎癥評分為0，第14天康復(fù)新液、氟康唑組炎癥評分為0，故圖中不予顯示。圖4 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠陰道局部炎癥的影響

圖5 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠陰道菌落定植情況的影響

圖6 康復(fù)新液對念珠菌性陰道炎模型小鼠陰道定植菌落數(shù)的影響

4 討論

中醫(yī)認為念珠菌性陰道炎患者多為素有肝經(jīng)濕熱，或肝郁脾虛、化熱生濕，久則濕熱之邪化為濕毒并隨經(jīng)下注，蘊結(jié)陰器，又濕熱蘊積生蟲發(fā)為陰癢，甚則灼痛，帶下異常或伴心煩不寐，胸悶不適，口苦而膩，納谷不香等，舌質(zhì)紅、苔黃膩，脈玄數(shù)或滑數(shù)。運用中醫(yī)藥思維，尋找相應(yīng)中藥及復(fù)方用來預(yù)防和治療陰道炎疾病具有很好的發(fā)展前景。

目前治療念珠菌性陰道炎的藥物如甲硝唑、環(huán)丙沙星等，微生態(tài)治療制劑如地衣芽孢桿菌，還有中藥洗劑如苦參洗劑等，不過存在可誘發(fā)耐藥性、復(fù)發(fā)率高、用藥不便、制劑困難等不足。因此，尋找更加安全、有效的治療藥物具有重要意義。目前可供臨床選擇的治療念珠菌性陰道炎的藥物主要有兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、酮康唑、依曲康唑等幾種藥物，其中氟康唑因其良好的生物利用度和較少的不良反應(yīng)，成為臨床應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥物[10]；但在長期治療和重復(fù)給藥過程中，誘使白色念珠菌快速產(chǎn)生耐藥性，導致氟康唑耐藥程度越來越嚴重，而且大部分耐氟康唑真菌對其他抗真菌藥物具有交叉耐藥性，使得目前的抗真菌藥物對越來越多的耐藥菌束手無策，這是導致臨床治療失敗的主要原因。鑒于目前臨床抗真菌用藥選擇范圍小、不良反應(yīng)大、耐藥性產(chǎn)生以及臨床治療失敗等原因，尋找新的抗菌譜廣、抗菌效果好、不良反應(yīng)小的中藥制劑已經(jīng)成為臨床抗真菌治療的發(fā)展方向之一。

康復(fù)新液屬于純天然昆蟲提取物，與傳統(tǒng)化學藥相比，來源豐富、藥用價值高、不良反應(yīng)低、安全性高、使用方便，不易產(chǎn)生耐藥性[11-12]，且康復(fù)新液具有廣泛抑菌、抗真菌、抗病毒、促生長、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、增強免疫、抗腫瘤的作用。研究康復(fù)新液對陰道炎菌群的抑制或殺滅作用不僅為開發(fā)利用美洲大蠊藥用資源提供了新的思路，也為臨床上治療念珠菌性陰道炎提供了新的候選藥物，減少廣大女性患者的痛楚。本研究對于合理、持續(xù)地開發(fā)利用美洲大蠊這一天然藥物資源具有重要的意義。

近年來對康復(fù)新液的研究越來越多，其藥物制劑在臨床上的應(yīng)用也越來越廣泛，主要用于胃、十二指腸潰瘍、褥瘡、外傷、燒傷、燙傷等疾病的治療。康復(fù)新液是美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物，其作為一種十分古老的昆蟲，是傳統(tǒng)的中藥材[13]，味咸、性寒；治血瘀癥、寒熱、破積聚、喉咽痹、內(nèi)寒無子[14]，常以干燥或鮮成蟲入藥，藥用歷史悠久[15]。研究發(fā)現(xiàn)康復(fù)新液在臨床皮膚科、鼻科、外科、婦科和口腔科的疾病治療中取得了新進展[11]，拓寬了康復(fù)新液的適應(yīng)癥范圍，提升了康復(fù)新液的藥用價值。目前國內(nèi)學者側(cè)重于美洲大蠊提取物藥用價值的開發(fā)和臨床應(yīng)用[16]，國外學者則偏重于各種化學成分的提取、鑒定、基因表達及分子生物學研究[17]。

本研究通過體外抑菌實驗簡便快捷地確認康復(fù)新液具有抗白色念珠菌標準株和23#臨床耐藥株作用，進而聯(lián)合體內(nèi)動物實驗，以標準株感染小鼠陰道，造成穩(wěn)定的念珠菌性陰道炎動物模型，進一步確證了康復(fù)新液抗白色念珠菌標準株作用。雖有研究證明康復(fù)新液對白色念珠菌具有抑制作用[7，18]，但是目前并未有報道明確表明康復(fù)新液抗白色念珠菌臨床耐藥株及其作用機制。后續(xù)將以臨床耐藥株為主要菌株，進一步確證康復(fù)新液抗臨床耐藥株作用。