三聚氰胺對雄性小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響*

夏鳳瓊， 楊國珍， 黃健， 林明春， 肖禮紅

(1.貴州省骨科醫院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學附院 生化科， 貴州 貴陽 550004)

隨著全球工業化的迅速發展，人類生殖健康受到的威脅日漸突出，男性精液質量下降十分顯著[1]。三聚氰胺作為一種不可缺少的工業化學品，廣泛地用于塑料、涂料、膠水、阻燃劑等行業，由于其含氮量高，再加上現有凱氏定氮法檢測蛋白質含量的缺陷，許多不法分子便趁機將三聚氰胺添加于食品中來提高食品的含氮量[2]，從而威脅人類健康[3]。研究表明，三聚氰對寵物貓、狗及實驗兔、鼠、豬具有一定的急性皮膚毒性、吸入毒性、眼睛刺激、腎臟毒性及肝臟毒性[4-9]；也有研究表明三聚氰胺可降低雄性小鼠體液免疫功能[10]，對雌性大鼠具有卵巢毒性[11]。關于三聚氰胺在生殖毒性方面的研究報道甚少，本研究以健康雄性昆明種小鼠為對象，用不同劑量的三聚氰胺通過灌胃對小鼠進行染毒，檢測小鼠睪丸組織的病理變化、睪丸細胞凋亡百分率及凋亡相關蛋白bcl-2、bax、caspase-3的表達，初步探討三聚氰胺對雄性小鼠的生殖毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物主要試劑和儀器

1.1.1實驗動物 選擇6～8周齡健康雄性昆明種小鼠50只，體質量25～30 g，購自于第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所醫學實驗動物中心，許可證號SCXK(渝)2001-0005。

1.1.2主要試劑和儀器 三聚氰胺(Sigma 公司，美國)，環磷酰胺(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司)，流式細胞儀(美國Becton Dickingson公司)，Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒(Santa Cruz 公司，美國)，Caspase-3免疫組化試劑盒(Cell Signaling公司，美國)，免疫組化二抗、AB顯色系統(武漢博士德生物工程有限公司)，顯微照相系統(四川大學Biomias圖像分析軟件)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型 將50只雄性小鼠隨機均分為陰性對照組、實驗組(三聚氰胺低、中、高劑量組)及陽性對照組。陰性對照組按0.1 mL/10 g體質量灌胃生理鹽水，實驗組分別按400、800、1 600 mg/kg體質量灌胃三聚氰胺，陽性對照組按40 mg/kg體質量腹腔注射環磷酰胺。各劑量組按照體重每天定時給藥1次，連續5 d。

1.2.2標本采集 于第一次染毒結束后的第35天，頸椎脫臼處死小鼠，立即剪開腹腔取出兩側睪丸，用生理鹽水洗凈睪丸上的血液，濾紙擦干，左側睪丸置于10% 中性甲醛中固定3 d后，常規取材、脫水、石蠟包埋制成切片；右側睪丸-20 ℃保存 ，用于檢測睪丸細胞凋亡。

1.2.3HE染色 左側睪丸組織切片采用與脫水、透明相反的步驟脫蠟至水，蘇木素溶液染色10 min，自來水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分色數秒，再經伊紅染色。切片經乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。光鏡下觀察小鼠睪丸組織結構。

1.2.4凋亡檢測 細胞懸液的制備 取小鼠 右側睪丸組織，剔除表面結締組織，消去被膜，加入適量的PBS，用眼科剪將睪丸剪碎，吸管吹打混勻，100目尼龍網過濾，800 r/min離心5 min，棄上清液，組織沉淀用PBS洗2次，制成細胞懸液(濃度為105～107/ml)。細胞懸液中加入5 μL 標記有異硫氰酸熒光素(FITC)的Annexin V，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻、避光30 min，流式細胞儀檢測，計算睪丸細胞凋亡率。

1.2.5免疫組化 左側睪丸組織切片采用SABC法進行免疫組化染色，二氨基聯苯胺(DAB)顯色法檢驗。光鏡下，細胞漿或細胞膜呈棕黃色為陽性表達。每張切片隨機選取5個視野，測得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達的平均灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 睪丸組織學

顯微鏡下結果顯示，陰性對照組小鼠睪丸組織曲細精管完整、排列整齊，可見精原細胞和不同發育階段的精母細胞、精子細胞及成熟精子，各級細胞排列緊密，層次分明(圖1A)。三聚氰胺各劑量組睪丸形態結構隨著染毒劑量的增加出現不同程度的損傷：低劑量染毒組損傷較不明顯，各級生精細胞排列較有序，管腔中成熟精子數量減少(圖1B)；中劑量染毒組可見生精細胞層數減少，管腔中精子數量減少(圖1C)；高劑量染毒組生精細胞排列紊亂、疏松，層數減少，管腔中精子數量減少(圖1D)；陽性對照組生精細胞層數減少，管腔中精子數量減少(圖1E)。

圖1 各組小鼠睪丸組織結構變化情況(HE，×400)Fig.1 Changes of testicular structure of mice in each group

2.2 蛋白Bcl-2 、Bax 及 Caspase-3表達

隨著染毒劑量的增加，三聚氰胺低、中、高劑量染毒組Bcl-2陽性表達較陰性對照組逐漸減少(灰度值升高)，差異有統計學意義(P<0.05)；三聚氰胺中、高劑量組Bax、Caspase-3較陰性對照組其反應隨染毒劑量增加而增強(灰度值降低)，差異有統計學意義(P<0.05)，與陽性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。應用BioMias圖像分析系統對各組實驗結果進行檢測。在40倍物鏡下，每張切片隨機選取5個視野(圖2)，測得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達的平均灰度值。見表1。

注：箭頭所示為陽性表達圖2 各組小鼠睪丸組織中bcl-2、bax、caspase-3表達(SABC，×200)Fig.2 Expression of bcl-2, bax and caspase-3 in each group of mice testis

組別睪丸組織蛋白表達Bcl-2BaxCaspase-3陰性對照組127.84±12.95 133.06±11.36 149.75±5.33 陽性對照組150.98±7.86(1) 109.54±5.65(1)129.70±7.22(1)三聚氰胺低劑量組139.03±5.08(1)(2)129.17±9.08(2)145.65±5.06(2)三聚氰胺中劑量組139.90±5.56(1)(2)114.40±8.50(1)131.20±14.38(1)三聚氰胺高劑量組141.15±9.23(1)(3)112.14±6.25(1)133.45±4.21(1)

(1)與陰性對照組比較，P<0.05；(2)(3)與陽性組比較，P<0.05

2.3 睪丸細胞凋亡率

隨著染毒劑量的增加，各實驗組睪丸細胞凋亡率呈上升趨勢，其中三聚氰胺高劑量組(23.404±3.488)與陰性對照組(16.871±3.610)比較，差異有統計學意義(P<0.05)，三聚氰胺低、中劑量組[(18.441±2.841)、(19.486±3.133)]與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

注：A為陰性對照組，B為三聚氰胺低劑量組，C為三聚氰胺中劑量組，D為三聚氰胺高劑量組，E為陽性對照組圖3 各實驗組睪丸細胞凋亡率Fig.3 Testicular cell apoptosis rate of different groups

3 討論

檢測化學品暴露對組織有無影響常采用的方法是病理學檢查[12-13]。本次實驗中所采用的化學暴露品是三聚氰胺，結果顯示不同劑量的三聚氰胺對各組小鼠的睪丸組織產生了不用程度的病理損傷。其中，生理鹽水(空白)對照組小鼠睪丸組織管腔內可見到大量成熟的精子細胞，生精小管及生精細胞排列規則、清晰；三聚氰胺低劑量組睪丸組織無明顯的病理學變化；三聚氰胺中劑量組可見到睪丸組織管腔中生精細胞數量減少，層數減少，生精小管排列紊亂；高劑量組小鼠睪丸組織已發生明顯萎縮。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡(PCD)。正常的細胞凋亡過程對機體并無有害影響。但是外界的有害物質可使機體啟動異常的凋亡程序，對機體產生不可逆的損傷。

雖然細胞凋亡是維持機體正常代謝所必須的，但是生精細胞的凋亡發生明顯增加則可能影響精子的正常生成而引起不育[14]，各種理化因素增加睪丸生精細胞凋亡，常常引起睪丸組織發生損傷[15]。在本次研究中，各組小鼠暴露于不同劑量的三聚氰胺后睪丸生精細胞均發生的不同程度的凋亡，并且隨著劑量的增加而增加。因此，本次研究表明，三聚氰胺可能誘導雄性小鼠睪丸生精細胞發生凋亡。

免疫組化結果表明，各劑量組小鼠睪丸組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達均增加，中、高劑量組增加顯著；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達卻明顯降低。因此，本次研究中，雄性小鼠睪丸組織生精細胞的凋亡可能是抗凋亡蛋白Bcl-2的表達減少及促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達增加有關。

綜上所述，三聚氰胺對雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用：睪丸組織結構發生病理損傷，管腔中生精細胞凋亡率增加，抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白表達異常，從而可能進一步引起小鼠精液質量的下降和精子數量的減少，對雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用。