miR-31在COPD患者外周血中的表達及其臨床意義

陳錦暖，吳 雷，葉樹培，陳美華

(東莞市第三人民醫院呼吸內科，廣東東莞 523326)

世界衛生組織(WHO)報道顯示2015年全球就有300萬人死于慢性阻塞性肺疾病(COPD)。COPD臨床表現為肺功能失常和氣道的重建，吸煙、環境的污染是COPD的主要危險因素，這些因素通過改變氣道的功能及免疫失調導致炎癥進展，從而利于感染的發生[1-2]。micoRNA在COPD中已有部分研究，并且其在COPD的進展及臨床表現中具有重要的作用[3]，近期報道顯示微小RNA-31(miR-31)在肺纖維化中起到負調控的作用[4]，對氣道慢性病毒性感染有促進作用，抑制T細胞的抗病毒功能，有利于病毒的感染入侵[5]。而T細胞在COPD患者中表現為功能減弱，如T細胞的趨化因子、功能因子等表達不足[5]，而在COPD患者中miR-31的表達是否異常，是否與T細胞的功能減弱相關，目前尚未有報道。研究者通過檢測COPD患者外周血單個核細胞(PBMC)中的miR-31表達量，探討miR-31與COPD的發生發展的關系。通過檢測COPD患者血漿中Th1和Th2類細胞因子水平，并進行相關性分析，探討miR-31在COPD中的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有研究對象均來自于東莞市第三人民醫院，經醫院倫理委員會的批準，并取得研究對象的知情同意。所有對象均按照中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》為診斷標準納入，共檢測了38例COPD患者(COPD組)和15例急性支氣管炎(AB)患者(AB組)，所有患者無自身免疫性疾病，入院取樣前無使用免疫調節劑。均采用第三代頭孢類藥物治療大于1周者為跟蹤治療組15例，另取40例體檢健康者作為對照組。

1.2 儀器與試劑 主要檢測儀器為實時熒光定量PCR儀(ABI Q6 Flex)；人白細胞介素4(IL-4)酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒(達科為)；人γ-干擾素(IFN-γ) ELISA檢測試劑盒(達科為)。主要試劑為Trziol(Thermo)、 TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgen Biotech)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TakaRa)、TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech)；miR-31 引物(上海生工合成)；人IL-4 ELISA檢測試劑盒和FIN-γ ELISA檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 標本均由本科室醫生或護士協助收集，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管每個樣本取5 mL全血，用淋巴細胞分離液分離得到PBMC，Trziol裂解液處理，于-80 ℃保存。血漿分管保存于-80 ℃保存備用。

1.3.2 miR-31表達量檢測 取出凍存標本，常溫下解凍，Trziol法提取總RNA，于核酸蛋白檢測儀中定量RNA，試劑盒ransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉錄成后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)，計算miR-31的相對表達量。

1.3.3 ELISA檢測血漿IL-4和IFN-γ水平 取出COPD患者血漿標本，常溫解凍，按照ELISA試劑盒推薦的方法與條件進行操作，終止顯色后在多功能酶標儀中讀取樣品孔中的吸光度值(A值)，利用標準曲線換算成樣品濃度。

1.3.4 患者實驗室相關數據的檢測 標本在抽取時同時送檢驗科做血常規及生化檢測。同時臨床測定COPD患者的肺功能：一秒呼氣容積(FEV1)。

2 結 果

2.1 各組一般情況比較 COPD組共38例，Ⅰ期患者12例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者12例。COPD組患者平均年齡為(72.84±9.61)歲；AB組患者15例，平均年齡為(68.8±5.67)歲；對照組40例，平均年齡為(69.15±6.73)歲，各組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。COPD組男女性別比為19/19、AB組男女性別比為8/7、對照組男女性別比為19/21，各組男女性別比相互比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組PBMC的miR-31的表達量比較 COPD組PBMC中miR-31的表達[(2.92±1.16)]明顯高于對照組[(1.10±0.48)]和AB組[(1.72±0.67)]，AB組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；其中15例COPD患者在抗菌藥物治療好轉跟蹤檢測，其PBMC中miR-31的表達治療后得到下降(P<0.05)，見圖1。

注：A為3組PBMC中miR-31的表達量比較；B為COPD患者治療前后miR-31的表達量比較

圖1 PBMC的miR-31的表達差異

2.3 COPD患者miR-31的表達量與患者疾病嚴重程度相關性分析 將COPD患者按照臨床分型分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。其中Ⅱ期[(3.04±0.95)]、Ⅲ期患者[(3.6±0.87)]PBMC中miR-31的表達量明顯高于Ⅰ期患者[(2.12±1.22)]。見圖2。

圖2 miR-31在各臨床分類COPD患者中的表達量差異

2.4 COPD患者PBMC中miR-31的表達量與各炎癥細胞間的相關性分析 COPD患者PBMC中miR-31的表達量與外周血CRP水平呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.663 8,P<0.05)；與外周血白細胞總數呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.472 6,P=0.005 5)；與外周血中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的比例無相關關系，見圖3。

注：A為miR-31的表達量與外周血CRP水平的相關性分析；B為miR-31的表達量與外周血白細胞數的相關性分析；C為miR-31的表達量與外周血中性粒細胞比例的相關性分析；D為miR-31的表達量與PBMC比例的相關性分析；E為miR-31的表達量與外周血淋巴細胞比例的相關性分析

圖3 COPD患者PBMC中miR-31的表達量與各炎癥細胞的相關性分析

注：A為miR-31的表達量與外周血CRP水平相關性分析；B為miR-31的表達量與外周血白細胞數的相關性分析；C為miR-31的表達量與外周血中性粒細胞比例的相關性分析；D為miR-31的表達量與PBMC比例的相關性分析；E為miR-31的表達量與外周血淋巴細胞比例的相關性分析

圖4 AB患者PBMC中miR-31的表達量與各炎癥細胞的相關性分析

2.5 AB患者PBMC中miR-31的表達量與各種炎癥細胞間的相關性分析 AB患者PBMC中miR-31的表達量與外周血CRP水平呈正相關，差異有統計學意義(r=0.681 5,P=0.014 7)；與外周血白細胞總數呈正相關，差異有統計學意義(r=0.587 3,P=0.021 3)；與外周血中性粒細胞的比例呈正相關，差異有統計學意義(r=0.662 5,P=0.007 1)；與PBMC比例無統計學意義(P>0.05)；與外周淋巴細胞比例呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.630 3,P=0.011 8)，見圖4。

2.6 COPD患者PBMC中miR-31的表達量與血漿中IL-4及IFN-γ水平相關性分析 已有報道顯示COPD患者血漿IL-4及FIN-γ水平與健康人水平比較具有明顯差異，因此通過檢測COPD患者血漿中IL-4及IFN-γ水平，分析miR-31的表達與分別主要來自于Th1類細胞的IFN-γ和Th2類細胞的IL-4的相關性，發現miR-31的表達與IL-4水平呈負相關，差異有統計學意義(r=-0.476 4,P=0.002 5)；與IFN-γ水平無相關關系，見圖5。

注：A為miR-31的表達量與血漿IL-4水平的相關性分析；B為miR-31的表達量與血漿IFN-γ水平的相關性分析

圖5 miR-31的表達量與血漿中IL-4及IFN-γ水平相關性分析

3 討 論

COPD病情的發展與多種因素相關，比如吸煙導致的缺氧[6]、病毒感染[7]、中性粒細胞和巨噬細胞的活化及內皮細胞和上皮細胞的凋亡[7-8]；另外基因的易感性及性別在COPD患者中的T細胞表型具有明顯差異[9]。因此肺部的微環境對COPD的病理變化起到重要作用。一些miRNA近來被證實在COPD患者中表達增高[10]。WANG等[11]在COPD患者血漿中證實了miR-145-5p、miR-636、miR-338-3p、miR-4485、miR-1229-3p、miR-4707-3p、和miR-3620-3p 表達增高。另外在外周血及患者痰液中也檢測到miRNA-145和miRNA-338的表達增高[12]。miR-31已在腫瘤中被證實具明顯的抑制腫瘤生長的功能[13-15]，特別是乳腺癌[16-17]。另外在感染性疾病中miR-31的表達也是異常，如結核病[18-19]、慢性病毒性感染中對CD8+T細胞的耗竭起到重要的作用[5,20]，另外在尋常型牛皮鮮中其表達也是異常[21]。檢測結果顯示COPD患者PBMC中miR-31表達增加，治療后得到下調。外周血中miR-31的表達量檢測已有報道，如系統性紅斑狼瘡患者[22]、肺癌患者的外周血[23]、小兒結核病外周血miR-31表達異常可能作為診斷的標志物[19]。因此miR-31參與了眾多疾病的發生發展過程，但在COPD患者中的作用機制目前尚未明確。另外嚴重的COPD患者其表達量更高，提示其表達與疾病的嚴重程度具有密切關系。進一步分析miR-31的表達與外周血炎癥細胞的相關性，以推測其可能的調節機制，發現其在COPD中與CRP和白細胞總數呈負相關，而在AB患者中，與外周血中性粒細胞呈正相關(r=0.662 5，P=0.007 1)。因此在COPD和AB患者中其可能與炎癥的負反饋調節相關。進一步檢測的血漿中IL-4及IFN-γ水平，結果顯示COPD患者PBMC中miR-31的表達與IL-4水平呈負相關(r=-0.476 4,P<0.05)，其可能對Th2類T細胞具有調節作用。已有報道顯示miR-31在膿毒血癥中通過調節Th2細胞發揮作用[24]，因此在COPD中miR-31可能抑制Th2細胞，間接促進炎癥性細胞的功能，有利于疾病的發展。但是該miRNA其功能靶點可能是多樣的，在各個疾病中的靶點不同，如在慢性病毒感染中其可增強T細胞對Ⅰ型干擾素的敏感性，從而干擾效應T細胞的功能，增強T細胞失能相關蛋白的表達[5]，也可以通過靶向結合基因STK40和LATS2調節角化細胞的生長和毛發的分化[25]，在肺癌中miRNA-31可通過抑制BAP1促進腫瘤細胞的增殖[14]，而在乳頭狀甲狀腺癌中其可通過RNA結合蛋白減弱腫瘤細胞的生長[26]，在肺纖維化中其可通過靶向結合整聯蛋白α減弱纖維化的發生[4]。

COPD患者中miR-31的增高，與疾病的發生發展具有密切關系，可能作為診斷或治療該疾病的靶點。同時結果顯示miR-31與Th2細胞因子IL-4具有相關性，提示miR-31可能對Th2類細胞起主要調節作用，該結果為進一步對其機制的探討提供了臨床實驗依據。

4 結 論

本文發現COPD患者外周血高表達miR-31，其表達與疾病的嚴重程度密切相關；miR-31的表達量與外周血中CRP和炎癥細胞水平具有相關性，提示其參與了COPD炎性反應過程，研究結果顯示COPD血漿中的IL-4水平與miR-31的表達量具有相關性，提示了miR-31可能對Th2類細胞具有調節作用。