MALDI-TOF MS 對臨床常見真菌鑒定準確性的Meta分析

張素婷，張 濤，黃 健，劉長今，駱詩露，閔 迅

(1. 遵義醫科大學附屬醫院醫學檢驗科，貴州 遵義 563000； 2. 遵義醫科大學檢驗醫學院，貴州 遵義 563000)

由于各種抗菌藥物的不斷更新換代，免疫抑制劑的不斷應用，以及支持治療手段的不斷進步，臨床真菌感染的患病率和致死率均較前明顯上升[1]。當前，臨床常見真菌主要以酵母型真菌和絲狀真菌感染所致危害最大，并且逐漸成為醫院感染的重要類型之一。臨床上對真菌的檢測主要有直接涂片法、真菌培養法以及病理學組織檢查等傳統方法，而針對真菌的早期診斷則多以檢測速度和準確性更好的G實驗、GM實驗以及PCR等方法為主。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 是近年發展起來的一種簡便、快速、準確、經濟的病原微生物鑒定方法[2]，其初期主要用于臨床細菌的鑒定。近年來，有學者將其應用到臨床病原真菌的鑒定領域。目前，臨床上主要以法國bioMérieux公司生產的Vitek MS，以及德國Bruker公司生產的Biotyper的應用最為廣泛。MALDI-TOF MS技術在細菌鑒定方面已經得到廣泛應用，但其在真菌鑒定能力方面的相關報道仍然較少[3-4]。因此，本研究擬針對不同MALDI-TOF MS分析系統對臨床常見真菌鑒定的準確性方面進行Meta分析，為臨床真菌感染的診斷及治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 納入標準 (1)研究類型：可提供MALDI-TOF MS技術檢測真菌的真陽性(true positive, TP)、假陽性(false positive, FP)、假陰性(false negative, FN)、真陰性(true negative, TN)的文獻；(2)研究對象：臨床血液、體液培養標本中分離的真菌菌株，或真菌標準菌株；(3)診斷實驗方法：待檢測技術為MALDI-TOF MS，以常規檢測方法或分子生物學方法為金標準；(4)結局指標：合并靈敏度(sensitivity, Sen)、特異度(specificity, Spe)、陽性似然比(positive likelihood ratio, +LR)、陰性似然比(negative likelihood ratio, -LR)、診斷比值比(diagnostic odds ratio, DOR)和匯總受試者工作特征(summary receiver operating characteristic, SROC)曲線下面積(area under curve, AUC)。

1.2 排除標準 (1)重復文獻，與MALDI-TOF MS檢測真菌準確性不相關文獻；(2)無詳細數據的會議摘要、綜述和專利等。

1.3 檢索策略 計算機檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國知網(CNKI)、中國生物醫學文獻數據庫(CBM)、維普中文科技期刊數據庫(簡稱維普)、萬方數據庫，查找MALDI-TOF MS與傳統方法或分子生物學方法比較檢測真菌準確性的文獻，檢索時限均為建庫至2018年6月30日。采用自由詞與主題詞相結合的方式進行檢索。中文檢索詞包括：基質輔助激光解析電離飛行時間質譜、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜、真菌、酵母菌屬、絲狀真菌屬、隱球菌屬、鑒定。英文檢索詞包括：MALDI-TOF MS、MALDI-TOF、fungus、yeasts、filamentous fungi、identification。

1.4 文獻篩選和資料提取

1.4.1 研究的選擇與資料提取 由2名研究人員根據納入、排除標準獨立進行文獻篩選，并對最終納入文獻的數據進行提取，如有不一致則交由第三方解決。提取的內容包括：第一作者、發表年限、菌株株數、菌株類別、檢測儀器、數據庫、菌種來源、TP、FP、FN、TN等相關信息。

1.4.2 文獻質量評價 文獻質量采用QUADAS-2工具進行評價[5]。QUADAS-2工具包括偏倚評價和臨床適用性兩部分。偏倚評價包括病例選擇、待評價試驗、金標準、病例流程和進展情況四個部分，臨床適用性則只包括前三個部分。所有領域的評價分為高風險、低風險、不清楚，并以高風險得0分、低風險得1分、不清楚得0.5分計算出每篇文獻的得分。質量評價由兩名研究人員獨立完成，如遇分歧則尋求第三方幫助。

1.5 統計分析 首先繪制受試者工作特征(ROC)平面圖，判斷是否為“肩膀狀”分布，并且計算Spearman相關系數，以分析有無閾值效應。若無閾值效應，則計算合并Sen、Spe、+LR、-LR。采用Q檢驗分析各研究間是否存在異質性，以I2估算分析異質性大小。當各研究結果間存在異質性時，采用隨機效應模型進行Meta分析，并采用亞組分析探討異質性來源；當各研究結果間不存在異質性時，則采用固定效應模型進行Meta分析。采用Meta-Disc 1.4軟件計算合并的Sen、Spe、+LR、-LR以及DOR，繪制SROC曲線、AUC。Meta分析的檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 文獻檢索納入和篩選流程 初步檢索到文獻1 222篇，其中CNKI 120篇、維普97篇、萬方數據庫58篇、CBM 281篇、PubMed 321篇、Embase 345篇，最終納入符合標準的文獻26篇[6-31]。文獻篩選流程及結果見圖1。

圖1 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準確性Meta分析納入文獻篩選流程圖

Figure 1 Flow chart of literature screening for Meta-analysis on accuracy of MALDI-TOF MS in identifying common fungi

表1 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準確性Meta分析納入文獻的基本特征

2.2 納入文獻的基本特征 26篇文獻的基本特征見表1。研究共包括9 708株真菌，其中酵母菌屬6 859株，絲狀真菌屬2 849株；18篇文獻[6-7,9-11,13,15,17-19,21-24,26-28,30]采用常規方法作為參考方法，3篇文獻[12,14,25]采用分子生物學技術作為參考方法，5篇文獻[8,16,20,29,31]采用分子生物學技術和常規方法作為參考方法，所有文獻均可獲取MALDI-TOF MS 鑒定真菌的TP、FP、FN、TN。

2.3 納入研究的偏倚風險評價 26篇文獻評分介于5.0～7.0分，中位數為6.5分，均為較高質量文獻。見表2。

表2 MALDI-TOF MS鑒定常見真菌準確性Meta分析納入文獻的偏倚風險評價

Table 2 Bias risk assessment on included literatures for Meta-analysis on accuracy of MALDI-TOF MS in identifying common fungi

文獻來源偏倚風險①②③④適用性①②③得分Bader [6](2011)LRLRURLRLRLRLR6.5Berrio [7](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5de Respinis [8](2013)URURLRLRURLRUR5.0Durán-Valle[9](2014)LRLRURLRLRLRLR6.5Elbehiry [10](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5Galán [11](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Gracheva [12](2013)LRLRURLRLRLRLR6.5Huang [13](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5Iranzo [14](2011)LRLRURLRLRLRLR6.5Jensen[15](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Lacroix [16](2014)LRLRURLRLRLRUR6.0Li [17](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Marklein [18](2009)LRLRURLRLRLRLR6.5Najafzaden [19](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Ninghui [20](2015)LRLRURLRLRLRUR6.0Posteraro [21](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Ranque [22](2012)LRLRURLRLRLRLR6.5Ranque [23](2014)LRLRLRLRLRLRLR7.0Reich [24](2009)URURURLRURLRLR5.0Ruiz [25](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Rychert [26](2018)LRLRURLRLRLRLR6.5Sariguzel [27](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Sow [28](2015)LRLRURLRLRLRLR6.5Westblade [29](2013)LRLRURLRLRLRUR6.0彭陽 [30](2017)LRLRURLRLRLRLR6.5奚海燕 [31](2015)LRLRURLRLRLRUR6.0

①：病例選擇；②：待評價實驗；③：金標準；④：病例流程和進展；LR：低風險；HR：高風險；UR：未知風險

2.4 Meta分析結果

2.4.1 異質性檢驗結果 ROC平面圖不呈“肩臂狀”分布，Spearman相關性分析顯示相關系數為-0.013，P=0.949，提示不存在閾值效應。見圖2。異質性檢驗結果提示存在明顯異質性，采用隨機效應模型進行Meta分析，結果顯示，MALDI-TOF MS鑒定真菌準確性的Sen合并=0.97[95%CI(0.97～0.97)]、Spe合并=0.85[95%CI(0.81-0.88)]、+LR合并=5.60[95%CI(4.55～6.90)]、-LR合并=0.02[95%CI(0.01～0.04)]、DOR=282.40[95%CI(149.50～533.46)]。見圖3、4。

圖2 MALDI-TOF MS鑒定真菌準確性的SROC曲線

Figure 2 SROC curve of the accuracy of MALDI-TOF MS for fungal identification

圖3 MALDI-TOF MS鑒定真菌靈敏度的Meta分析

Figure 3 Meta-analysis on sensitivity of MALDI-TOF MS for fungal identification

2.4.2 亞組分析結果 (1)菌株來源：納入的26篇文獻中，有5篇[7,20-22,27]研究菌株來源于標準菌株，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.99[95%CI(0.97～1.00)]，Spe合并=0.74[95%CI(0.55～0.88)]；17篇[6,8,11-17,19,23,25-26,28-31]研究菌株來源于臨床分離株，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.82～0.89)]；4篇[9-10,18,24]研究菌株兩種來源均有，Meta分析結果顯示，Sen合并=1.00[95%CI(0.99～1.00)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.73～0.94)]；兩種單一菌種來源的文獻DOR值相當，而同時滿足兩種菌株來源的文獻，其DOR高于單個菌株來源的文獻。(2)菌種：有17篇文獻[6-7,9,11-12,14-20,25,27-29,31]研究的對象是酵母菌屬，Meta分析的結果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.97～0.98)]，Spe合并=0.87[95%CI(0.82～0.91)]；9篇文獻[8,10,13,21-24,26,30]研究的對象是絲狀真菌屬，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.96[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.83[95%CI(0.78～0.88)]；兩種不同菌種文獻的DOR值相當。(3)參考方法：3篇文獻[12,14,25]僅采用分子生物學方法作為參考，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.91[95%CI(0.89～0.93)]，Spe合并=0.85[95%CI(0.66～0.96)]；18篇文獻[6-7,9-11,13,15,17-19,21-24,26-28,30]僅采用常規方法作為參考，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.97[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.85[95%CI(0.80～0.89)]；5篇文獻[8,16,20,29,31]采用兩種方法作為參考，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.99[95%CI(0.98～0.99)]，Spe合并=0.87[95%CI(0.77～0.93)]；僅采用分子生物學方法研究的DOR值低于常規方法和同時采用兩種方法研究的DOR值。(4)儀器：15篇文獻[6-10,17,20,22,24-29,31]采用bioMérieux，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.96[95%CI(0.96～0.97)]，Spe合并=0.83[95%CI(0.75～0.89)]；11篇文獻[11-16,18-19,21,23,30]采用Bruker，Meta分析結果顯示，Sen合并=0.98[95%CI(0.97～0.98)]，Spe合并=0.86[95%CI(0.82～0.90)]，Bruker檢測真菌準確性DOR值高于bioMérieux。見表3。

圖4 MALDI-TOF MS鑒定真菌特異度的Meta分析

Figure 4 Meta-analysis on specificity of MALDI-TOF MS for fungal identification

表3 MALDI-TOF MS鑒定真菌準確性的亞組分析

3 討論

MALDI-TOF MS 是近年來廣泛應用于臨床微生物實驗室病原菌鑒定的一項技術，在病原菌分型、耐藥檢測、毒力因子鑒定等方面發揮著重要作用[32-36]。該技術在細菌鑒定中的應用比較成熟，但在真菌鑒定尤其是絲狀真菌鑒定中的應用缺少臨床實踐和經驗積累[37]。本研究納入文獻26篇，9 708株真菌,基本涵蓋了臨床常見真菌，其中酵母菌屬占70.7%，絲狀真菌屬占29.3%。ROC曲線將Sen與Spe以圖示方法結合在一起，可準確反映某分析方法Sen和Spe的關系，是試驗準確性的綜合代表。本研究ROC曲線顯示，MALDI-TOF MS的AUC為0.9078，Q*統計量為0.8397，說明MALDI-TOF MS鑒定臨床常見真菌具有較高的準確性。此外，似然比(likelihood ratio, LR) 檢驗是反映真實性的一種指標，該指標全面反映篩檢試驗的診斷價值。本研究得出的+LR合并為5.60，-LR合并為0.02，提示陽性結果及陰性結果均有較高的準確性。

鑒于本研究中ROC平面圖不呈典型的“肩臂狀”分布，提示本文納入的文獻間可能存在異質性。經Spearman相關系數檢驗，該異質性與閾值效應無關，因此，本研究進一步采用隨機效應模型進行Meta分析，結果顯示，MALDI-TOF MS 在真菌鑒定上具有極高的Sen合并(0.97)及Spe合并(0.85)，說明MALDI-TOF MS對真菌感染有較低的漏診率和誤診率。亞組分析結果顯示：(1)MALDI-TOF MS技術對真菌臨床菌株組、標準菌株組、臨床菌株+標準菌株組鑒定的Sen及Spe相近；其對兩種菌株組鑒定的DOR值高于單個菌株來源組，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。(2)MALDI-TOF MS技術對臨床常見酵母菌屬及絲狀真菌屬鑒定的Sen、Spe及DOR值相當。(3)Bruker品牌MALDI-TOF MS儀器對臨床常見真菌鑒定的Sen、Spe及DOR值均高于bioMérieux品牌，但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。以上結果提示MALDI-TOF MS技術對臨床酵母菌屬及絲狀真菌屬的鑒定，不受菌株來源、儀器品牌等因素影響，均具有很好地鑒定效果。但在MALDI-TOF MS技術與不同的參考方法比較中，分子生物學組的Sen最低[Sen合并=0.91，95%CI(0.89～0.93)]，且該組的DOR值較常規方法組和同時采用兩種方法組均偏低，組間比較差異具有統計學意義(P<0.01)?？赡芘c前者僅納入3篇文獻，在一定程度上造成了DOR值偏倚所致。本Meta回歸結果提示，參考方法的不同可能是導致臨床常見真菌鑒定結果存在異質性的重要原因。

盡管MALDI-TOF MS技術在臨床真菌鑒定方面得到了長足發展，但其仍存在以下不足：臨床常見病原真菌的參考質譜數據庫尚不夠完善；檢測前標本的預處理及蛋白提取尚未能建立標準化程序；在不同的培養基、培養溫度及培養時間，真菌蛋白表達差異可能會影響鑒定結果[38]。此外，少數臨床真菌因缺乏特異性峰值或峰數目不足，從而導致其產生的譜值過低而不能鑒定[39]，以及MALDI-TOF MS 技術對真菌耐藥性檢測方法尚未取得突破性進展等，均是影響MALDI-TOF MS 技術在臨床廣泛應用的主要原因。

此外，本Meta分析尚存在以下局限性：(1)由于臨床感染真菌多達400余種，因此存在檢索文獻不全的情況，而且檢索范圍多局限在已經發表的英文及中文文獻，對于未公開發表的研究可能造成漏檢。(2)MALDI-TOF MS 技術在真菌耐藥性檢測的診斷性試驗中，由于多數研究未報告是否采用盲法檢測，因此存在測量偏倚的可能性。(3)對部分少見、罕見的臨床真菌感染病例未能納入?？赡軙藶榈奶岣進ALDI-TOF MS對臨床常見真菌鑒定的準確性。

綜上所述，MALDI-TOF MS對臨床常見真菌鑒定具有較高的準確性。隨著MALDI-TOF MS鑒定數據庫的不斷完善、軟件功能的不斷更新、影響因素的不斷明確，以及對耐藥菌株檢測能力的不斷增強，MALDI-TOF MS 技術將為臨床真菌的鑒定提供更為方便、快捷、準確的實驗結果。