耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分子流行病學研究

龔 林，劉小麗，許慧瓊，梁建生

(武漢市疾病預防控制中心消毒與病媒生物防制所，湖北 武漢 430015)

由于碳青霉烯類抗生素抗菌活性強且抗菌譜廣，逐漸成為臨床上治療重癥感染的主要藥物[1]。但是，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛應用，耐碳青霉烯類藥物的細菌不斷增加，降低了該類藥物的治療效果[2]。細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制之一是產碳青霉烯酶，通過分析產碳青霉烯酶菌株的分子流行特征，對預防和控制耐藥菌的產生和耐藥基因的傳播具有重要意義。本研究對武漢兩所醫院臨床分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)進行分子流行病學研究，為臨床采取合理的防控措施提供實驗室參考依據[3]。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集武漢兩所醫院2018年1—10月臨床分離的非重復CRKP共42株。對亞胺培南，美羅培南和厄他培南3種藥物其中的1種耐藥，定義為耐碳青霉烯類藥物。

1.2 儀器與試劑 主要儀器: PCR 擴增儀(美國ABI公司),全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國梅里埃公司),脈沖場凝膠電泳儀(美國伯樂公司),凝膠成像儀(美國UVP公司)。主要試劑: 細菌DNA提取試劑盒(北京康為世紀公司)，PCR反應試劑盒(日本Takara公司)。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 細菌的鑒定和藥敏試驗采用全自動細菌鑒定及藥敏分析系統完成，大腸埃希菌ATCC 25922作為對照菌。藥敏分析結果按2018年版美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準進行判斷。

1.4 碳青霉烯酶表型檢測 采用Carba NP試驗對CRKP菌株產碳青霉烯酶情況進行初篩。制備Carba NP溶液A和Carba NP溶液B，然后刮取平板上隔夜培養的受試菌株，分別加入裝有Carba NP溶液A和Carba NP溶液B的離心管中，(35±2)℃孵育，孵育過程中每隔一段時間觀察結果。結果判定：(1)若溶液A為紅色或橙紅色，且溶液B為淺橙色、黃色或深黃色，則結果判定為陽性；(2)若溶液A為紅色或橙紅色，且溶液B為紅色或橙紅色，則結果判定為陰性；(3)若溶液A為橙色、淺橙色、黃色或深黃色，則結果判定為無效，應結合其他試驗判定。

1.5 碳青霉烯耐藥基因擴增 采用細菌DNA 提取試劑盒并按照試劑盒提供的實驗方法提取菌株DNA。采用普通PCR 方法擴增常見碳青霉烯耐藥基因(包括KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48)。依據相關參考文獻[4-8]設計引物和PCR擴增反應。PCR反應體系共50 μL，包括PCR反應試劑mix 25 μL，上、下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，最后加H2O補足體積。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，選取陽性產物條帶送往生工生物有限公司進行測序。

1.6 質粒接合試驗 分別取隔夜培養的供體菌(攜帶碳青霉烯耐藥基因的CRKP)和受體菌(大腸埃希菌J53 AZr)菌液，混合后于35 ℃培養4 h，然后接種于雙抗LB平板(含疊氮化合物100 mg/L，亞胺培南1.5 mg/L)上篩選接合轉移子[9]。將雙抗平板上生長的菌株作菌落PCR試驗，若PCR擴增結果為陽性，則可判定為接合試驗成功。

1.7 菌株間親緣關系分析 通過脈沖場凝膠電泳試驗(PFGE) 分析產碳青霉烯酶基因CRKP菌株的親緣關系。菌株包埋入膠塊后，經裂解和清洗，使用限制性內切酶XbaI 進行酶切，然后在0.5×TBE 緩沖液中電泳18.5 h。電泳參數為電壓6 V/cm、溫度14 ℃、脈沖時間6～36 s。采用BioNumerics軟件分析電泳凝膠成像圖譜，圖譜結果判讀依據Tenover等[10]建議的標準。

2 結果

2.1 菌株來源 42株CRKP，其中分離自痰28株(66.7%)，分泌物6株(14.3%)，尿5株(11.9%)，血2株(4.8%)和穿刺液1株(2.4%)。來源科室分別為ICU 19株(45.2%)，呼吸內科11株(26.2%)，肝膽外科4株(9.5%)，普通外科4株(9.5%)，腦血管外科2株(4.8%)，急診科和神經內科各1株(各占2.4%)。

2.3 碳青霉烯酶表型和基因檢測結果 經Carba NP試驗檢測，碳青霉烯酶陽性率為33.3%(14/42)。PCR結果顯示，13株耐藥基因檢測陽性，其中NDM陽性10株， KPC陽性3株。所有攜帶碳青霉烯酶基因的菌株Carba NP試驗結果均為陽性。所有菌株均未檢出VIM、IMP和OXA-48基因。NDM和KPC陽性產物經測序比對后，分別確定為NDM-1基因和KPC-2基因。Ⅰ醫院檢出5株NDM-1陽性菌株，Ⅱ醫院檢出5株NDM-1和3株KPC-2陽性菌株。見表1。

圖1 42株肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的耐藥率

編號醫院來源科室Carba NP試驗耐藥基因編號醫院來源科室Carba NP試驗耐藥基因WH1Ⅰ尿普外科+NDM-1WH22Ⅱ痰ICU+KPC-2WH2Ⅰ尿普外科-WH23Ⅱ尿ICU+KPC-2WH3Ⅰ痰ICU-WH24Ⅱ分泌物肝膽外科-WH4Ⅰ尿普外科-WH25Ⅱ分泌物呼吸內科-WH5Ⅰ痰急診科+WH26Ⅱ痰呼吸內科+NDM-1WH6Ⅰ痰神經內科-WH27Ⅱ痰ICU-WH7Ⅰ痰ICU+NDM-1WH28Ⅱ痰呼吸內科+NDM-1WH8Ⅰ痰ICU+NDM-1WH29Ⅱ痰腦血管外科-WH9Ⅰ痰ICU-WH30Ⅱ痰ICU-WH10Ⅰ痰ICU-WH31Ⅱ穿刺液肝膽外科+NDM-1WH11Ⅰ痰ICU-WH32Ⅱ分泌物ICU-WH12Ⅰ尿普外科+NDM-1WH33Ⅱ痰ICU-WH13Ⅰ痰ICU-WH34Ⅱ痰腦血管外科-WH14Ⅰ痰ICU-WH35Ⅱ痰ICU-WH15Ⅰ分泌物呼吸內科-WH36Ⅱ痰呼吸內科-WH16Ⅰ分泌物ICU-WH37Ⅱ痰呼吸內科+NDM-1WH17Ⅰ痰ICU+NDM-1WH38Ⅱ痰呼吸內科-WH18Ⅱ痰呼吸內科-WH39Ⅱ痰呼吸內科-WH19Ⅱ痰呼吸內科-WH40Ⅱ血ICU+NDM-1WH20Ⅱ痰ICU+KPC-2WH41Ⅱ痰呼吸內科-WH21Ⅱ血肝膽外科-WH42Ⅱ分泌物肝膽外科-

2.4 質粒接合試驗和菌株藥敏結果 10株NDM-1陽性CRKP菌株與大腸埃希菌J53的質粒結合試驗獲得了9個接合子，僅WH12 CRKP菌株未能接合成功。供體菌、接合子與受體菌藥敏結果顯示，除對氨曲南敏感外，所有接合子對絕大多數β-內酰胺類藥物耐藥，但耐藥水平較供體菌有所降低。部分接合子對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環素類藥物敏感，但MIC值高于受體菌。3株KPC-2陽性菌株均接合成功，接合子對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類藥物均耐藥，對阿莫西林/克拉維酸、氨基糖苷類、四環素類藥物均敏感。

2.5 菌株間親緣關系分析 PFGE分析結果顯示，10株NDM-1陽性CRKP菌株圖譜共分為6個型別，分別定義為A、B、C、D、F、G型；其中D型、E型各3株，C型和F型分別各2株，A型、B型和G型各1株，其中3株D型均來自Ⅱ醫院呼吸內科，2株F型均來自于Ⅰ醫院的ICU。3株KPC-2陽性菌株均為E型，來自于Ⅱ醫院的ICU。見圖2。

圖2 攜帶碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌PFGE 分析

3 討論

肺炎克雷伯菌常定植于人體腸道和呼吸道，可引起消化道、血液、呼吸道、皮膚軟組織等部位感染，是臨床上常見的條件致病菌之一[11]。碳青霉烯類藥物作為廣譜抗菌藥物，是治療肺炎克雷伯菌的重要藥物之一，隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應用，CRKP逐年增加。本研究中分離的CRKP菌株大部分來源于ICU，患者病情嚴重、長期住院、免疫力低下，較容易感染耐藥菌。同時，CRKP多分離自痰標本，提示此類耐藥菌常定植于呼吸道，引起呼吸系統感染。NDM-1和KPC-2的檢出率分別為23.8%(10/42)和7.1%(3/42),低于既往研究[12-14]的數據，提示產NDM-1和KPC-2的CRKP菌株在此兩所醫院流行率相對較低。另外，也可能是醫院監測系統不完善，未能發現所有產酶菌株。

本研究顯示，14株CRKP菌株Carba NP試驗初篩碳青霉烯酶陽性，經過PCR檢測顯示其中有13株CRKP菌株擴增出碳青霉烯酶基因，僅有1株CRKP菌株未能擴增出碳青霉烯基因，表明Carba NP試驗在檢測碳青霉烯酶時具有很高的靈敏度和特異度。Vasoo等[15]研究結果表明，Carba NP試驗對常見的碳青霉烯酶(OXA-48除外)檢出率很高，靈敏度和特異度接近100%。與本實驗研究結論類似，表明該方法可以用于對碳青霉烯酶進行初篩。

本研究13株產碳青霉烯酶CRKP菌株中有12株成功進行了質粒接合試驗，表明耐藥基因可通過質粒介導在不同細菌間水平傳播。對接合子和受體菌的藥敏結果進行分析，攜帶NDM和KPC基因的菌株對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類等抗菌藥物的MIC均相對較高。對接合子和供體菌的藥敏結果進行分析，供體菌除了攜帶碳青霉烯基因外，可能還獲得了其他耐藥元件、耐藥基因或其他耐藥機制等，使得菌株產生更高水平的耐藥。

本研究對13株攜帶NDM-1基因和KPC-2基因的CRKP進行PFGE分型，結果顯示10 株攜帶NDM-1基因CRKP菌株共分為6個型，無明顯優勢型；然而，3株攜帶KPC-2基因CRKP菌株則為同一型別，且集中分布于ICU。PFGE分型結果提示，兩所醫院可能存在KPC-2基因克隆傳播，NDM-1基因克隆傳播和水平傳播并存的現象。此兩種方式會加速碳青霉烯酶基因在醫院內和醫院間的傳播，從而引起更多的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物產生耐藥。

綜上所述，兩所醫院分離的CRKP與其攜帶的碳青霉烯酶基因NDM-1和KPC-2有關，且該類基因可通過質粒轉移在細菌間進行水平傳播。因此，應高度重視碳青霉烯酶基因導致的碳青霉烯類耐藥[16]，制定和實施有效的多重耐藥菌防控措施，從而可減少其在醫院內和醫院間的傳播。