秋水仙素對渥丹百合種子多倍體誘導的影響

王宇婷，張雅倩，楊青杰

(東北林業大學 園林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

渥丹百合(LiliumconcolorSalisb.)屬百合科百合屬的多年生球根植物[1]，花呈直立、星狀開展，深紅色小型花朵、無斑點，是東北地區百合屬植物育種的優良資源，因其具有觀賞價值高、適應性強、耐寒等優良特征，備受人們的青睞。渥丹百合同時還具有食用、藥用價值，亦可作香料。目前,未見渥丹百合在園林綠化及室內裝飾方面的應用研究報道，若經過引種馴化和適當篩選，其在園林應用上將會是很好的材料，在未來培育適應東北地區百合屬觀賞植物方面具有很大潛力。

多倍體育種具有多目標性狀的綜合改良效果，對于新品種選育及育種工作的發展進步具有重大意義[2]。有研究表明，經秋水仙素誘變處理得到的百合植株大多數都屬于嵌合體，很容易恢復又突變為二倍體植株[3]。因此，對于誘導獲得的變異植株必須要進行多倍體鑒定，以確保其能夠具有穩定的多倍性。李旦等[4]對野生紫斑百合的叢生芽進行多倍體誘導研究表明，用浸泡法對紫斑百合的叢生芽進行多倍體誘導時，以秋水仙素濃度為0.3%、浸泡處理12 h獲得的誘變效果最佳，并通過形態觀察、氣孔觀測和染色體壓片計數等方法鑒定了變異植株。目前，國內有關于渥丹百合的研究僅限于居群的核型分析及Giemsa C-帶法的染色體分析[5-6]，其染色體誘導加倍方面的研究也僅有對誘導后植株個體的氣孔方面的描述[7]。為探究秋水仙素誘導渥丹百合加倍的最適條件，筆者等通過秋水仙堿誘導渥丹百合染色體加倍，并對誘變植株進行鑒定，獲得染色體加倍的渥丹百合誘變個體和最佳誘導條件，旨在為渥丹百合的應用及未來的育種研究奠定理論和實踐基礎，同時也可為北方地區的園林綠化提供新的素材。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為渥丹百合種子，購于吉林長春。試驗用試劑分別為秋水仙素、蒸餾水、堿性品紅、苯酚、70%酒精、冰醋酸、福爾馬林(38%甲醛溶液)、山梨醇、濃鹽酸和無水乙醇，均購于哈爾濱雨澤科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 挑選飽滿成熟、胚呈棕黃色且完整的渥丹百合種子800粒，用濃度為2%的次氯酸鈉溶液漂洗15～20 min，再用清水漂洗15～20 min后備用。

1.2.2 秋水仙素誘導 于遮光條件下用電子天平秤取秋水仙素粉末放入燒杯，再用量筒量取蒸餾水加入燒杯，配制濃度為0(對照)、0.02%、0.05%、0.10%和0.15%的秋水仙素溶液各50 mL，分別移至5個燒瓶中，作好標記，備用。將渥丹百合種子分成5組，每組160粒，分別浸泡在上述配置好溶液中。每個濃度梯度再分為4組，每組40粒，分別設置24 h、48 h、72 h、96 h浸泡處理時間。

1.2.3 處理種子培養 秋水仙素處理結束后將渥丹百合種子移至培養皿，放入模擬土壤環境的培養箱中培養7～10 d，記錄種子發芽時間及數量，待種子長出強健粗壯的根毛后，移入花盆中進一步培養。培養期間定期澆水，觀察試驗結果并拍照記錄種子生長狀況。花盆土配制：將壤土、珍珠巖、蛭石以2∶1∶1的比例混合后滅菌處理，待混合土溫度降至20℃左右后置于花盆。

1.2.4 根尖壓片 待渥丹百合幼苗生長至葉片近完全展開后，取1～3 cm生長狀況良好的須根根尖，取樣時間為9:00、9:20、9:40、10:00。分別剪取根尖進行預處理、固定、解離、漂洗、染色、制片。然后根據壓片情況，找出其在細胞中期附近的2個時間點，在此區間再設置4個時間梯度，重復上述過程，以明確最佳中期分裂取樣時間。預處理：將根尖清洗后置于4℃實驗室冰箱中低溫水浴保存24 h。固定：經過預處理的根尖，用水洗凈后再用濾紙吸干表面水分。用卡諾固定液(無水乙醇∶冰醋酸為3∶1，現用現配)固定24 h后置于4℃實驗室專用冰箱中保存備用。解離：取固定好的根尖置于小燒杯內，加解離液(1 mol/L HCl溶液)后室溫處理6～8 min。漂洗：解離后用蒸餾水小心沖洗8～10 min。染色：將根尖放置于載玻片上，在根尖頂端部位截取2～3 mm的分生區，用濾紙吸干其表面的水分，然后滴加1滴卡寶品紅染液，分別染色10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，根據觀察顯示的著色情況找出最適染色時間，染色后用45%的乙酸進行分色1～2 min，再用濾紙吸去多余的染色液。壓片：用酒精燈外焰加熱1～2 s迅速移開[8]，如此反復4～5次后加蓋玻片。用帶有橡皮頭的鉛筆均勻用力壓片，直至材料呈霧狀后結束壓片。觀察：先在低倍鏡下(10×)找到渥丹百合分生區的細胞，然后換高倍鏡(40×)觀察。找出各處理組中明顯處于各分裂時期的細胞，并對染色體的形態進行觀察，對細胞分裂中、后期的染色體進行計數。若染色體形態清晰且處于分裂中、后期的細胞較多，則可將其制作成永久壓片標本長期保存。

1.2.5 葉片的形態學鑒定 進行染色體數目及形態鑒定后，確定所有的變異植株，繼續培養。同一試驗環境下相同生長階段，對標記好的四倍體植株與二倍體植株的外部形態特征即葉片的長度、寬度、厚度等指標進行測定比較。

1.2.6 葉片的細胞學鑒定 待渥丹百合幼苗生長至一定階段，取相同生長狀態和相同數量的四倍體植株和二倍體植株葉片，取其中部進行氣孔檢測。因為百合屬植物葉片中部的氣孔大小相對更為穩定[9]，且該部位氣孔變化幅度不明顯。在顯微鏡物鏡為20×的視野下，隨機選擇20個視野的保衛細胞，測量其長度、寬度并計算出平均值，統計氣孔密度。

1.3 測定項目

統計種子發芽率、發芽指數(GI)、成活率、變異率及幼苗葉型指數。

發芽率=發芽種子數/種子總數×100%

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)[10]

式中，Gt為在時間t天內的發芽個數，Dt為t所代表的的天數。

成活率=可成長幼苗的種子數/種子總數×100%；

變異率=誘變為多倍體的植物株數/處理的種子總數×100%。

葉型指數=葉片長度/葉片寬度。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素對渥丹百合種子萌發的影響

在種子萌發的過程中，對照(無秋水仙素處理，清水浸泡)的種子最先出現萌發跡象，0.02%秋水仙素處理的次之，0.15%秋水仙素處理的萌發最慢。從表1看出，清水浸泡(對照)96 h的發芽率最高，為97.5%；0.15%秋水仙素處理48 h和96 h的發芽率最低，均低于50%。總體看，對照渥丹百合種子發芽率隨浸泡時間延長呈增高趨勢，秋水仙素處理的渥丹百合種子發芽率隨秋水仙素濃度升高，整體發芽水平逐漸降低。表明，秋水仙素對渥丹百合的種子的萌發有一定的抑制作用，且隨濃度增加，抑制作用越明顯。

表1 不同濃度秋水仙素處理渥丹百合種子的萌發情況

2.2 秋水仙素對渥丹百合胚根發育的影響

渥丹百合種子經不同濃度的秋水仙素處理后，較對照處理(清水浸泡)其萌發出的胚根普遍明顯膨大(圖1)。經秋水仙素處理的胚根大多呈淺綠色，而對照種子胚根大多呈乳白色。同時可觀察到，萌發后期秋水仙素處理的種子其根毛生長速度較對照緩慢。

注：A,B,C,D分別為浸泡24 h,48 h,72 h,96 h的處理組，橫向為種子生長時間，縱向為秋水仙素濃度。

Note: The seed-soaking hours of A, B, C and D treatments are 24 h, 48 h, 72 h and 96 h separately. The transverse direction is seed growth days. The longitudinal direction is colchicine concentration.

圖 1不同濃度秋水仙素處理渥丹百合種子的萌發過程

Fig.1 Germination process ofL.concolorseeds treated with different colchicine concentration

2.3 秋水仙素對渥丹百合幼苗成活率的影響

從表2看出，秋水仙素處理的渥丹百合幼苗的成活率普遍低于對照，表明，秋水仙素影響渥丹百合幼苗成活，且隨濃度增加影響越明顯。相同濃度秋水仙素處理條件下，不同處理時間之間成活率差異明顯，低濃度下隨處理時間延長成活率提高；而高濃度條件下，成活率隨處理時間延長而降低。

表2不同濃度秋水仙素處理渥丹百合幼苗的成活率

Table 2 Survival rates of seedlings germinated fromL.concolorseeds soaked in different colchicine concentration

秋水仙素/%ColchicineConcentration處理時間/hTreatment hours移栽數/個Number oftransplanted seedlings成活數/個Survival number成活率/%Survival rate0243636100.0048373594.59723838100.0096393897.440.0224352880.0048353085.7172343294.1296323093.750.0524342882.3548333090.9172312580.6596302480.000.1024262076.9248241875.0072231252.1796201155.000.1524241562.5048191368.4272261246.15 9619842.11

2.4 誘導處理后幼苗根尖倍性鑒定

普通渥丹百合為二倍體，其植株體細胞內染色體數量為16～18條(圖2)，經秋水仙素處理后成功誘導加倍，加倍后的幼苗根尖體細胞內染色體數目增為原來的1倍左右，即獲得渥丹百合四倍體(圖3)。在不同濃度的秋水仙素誘導中，0.05%秋水仙素浸泡48 h處理的染色體加倍現象十分明顯。

圖2 清水浸泡48 h 處理組渥丹百合幼苗根尖染色體情況

Fig.2 Morphology of root tip chromosome ofL.concolorseeds soaked in water for 48 h

圖30.05% 秋水仙素浸泡48 h 處理渥丹百合幼苗根尖染色體情況

Fig.3 Morphology of root tip chromosome ofL.concolorseeds soaked in 0.05% colchicine solution for 48 h

2.5 秋水仙素對渥丹百合種子四倍體誘導效果

從表3看出，0.05%秋水仙素浸泡48 h處理的誘變效果最佳，其變異率為20%；其次是0.02%秋水仙素處理96 h，變異率為17.5%；0.05%秋水仙素處理72 h也可獲得相對較好的誘變效果。表明，適宜的秋水仙素濃度和處理時間是獲得大量渥丹百合四倍體的關鍵因素。

表3不同濃度秋水仙素處理渥丹百合的變異率

Table 3 Effect of different colchicine concentration on mutation rate ofL.concolorseedlings

秋水仙素/%ColchicineConcentration處理時間/hTreatment hours變異數/個Mutation number變異率/%Mutation rate02400 4800 7200 9600 0.022425 48410.072512.596717.50.0524512.548820.072615.096410.00.1024410.04825.07225.09600 0.152437.54825.07200 9612.5

2.6 渥丹百合二倍體與四倍體幼苗的形態學及細胞學差異

2.6.1 形態學差異 從表4看出，渥丹百合四倍體植株的葉片長度、寬度和厚度均明顯大于二倍體，分別為二倍體植株的109.65%、107.39%和163.16%。四倍體植株的葉型指數隨之變小，為二倍體的93.34%。整體上看，四倍體植株表現為葉片寬大、葉柄色澤更深、葉片顏色更濃綠、根系粗壯等特征，體現了多倍體植株的器官巨大性的特點。葉片厚度、長度以及葉形指數可作為初步鑒別四倍體植株與二倍體植株的重要指標。

表4 渥丹百合四倍體與二倍體植株葉片形態差異

2.6.2 細胞學差異 植株葉片氣孔的變化是植物多倍化的一個重要細胞學鑒定指標。從表5看出，渥丹百合四倍體植株葉片的保衛細胞較二倍體明顯增大，其平均長度為二倍體植株的167.45%，平均寬度的為二倍體的158.74%；同時，四倍體植株的氣孔密度明顯下降，為二倍體的61.09%。

表5 渥丹百合四倍體與二倍體植株葉片的細胞學差異

3 結論與討論

研究結果表明，渥丹百合的種子發芽率隨秋水仙素濃度升高逐漸降低。通過秋水仙素處理渥丹百合種子可以有效誘導多倍體植株的形成，0.05%秋水仙素處理48 h為誘導渥丹百合染色體加倍較適宜的濃度與處理時間，誘變率達20.00%。秋水仙素在誘發種子染色體加倍時，會對細胞產生毒副作用，進而影響其生長發育[11]。劉靜等[12]通過對蘭州百合進行秋水仙素加倍處理發現，相同處理時間條件下，隨秋水仙素濃度增大，鱗莖數與小鱗莖產生率逐漸減少；秋水仙素濃度相同時，隨著處理時間延長，鱗莖數、小鱗莖產生率也逐漸減少。

對根尖進行壓片處理時，最佳取材時間為9:30-9:35，這段時間內渥丹百合根尖的有絲分裂最為旺盛，壓片效果最好。趙慶等[8]對萬壽菊根尖染色體觀測最優方法進行研究表明，有絲分裂前中期為最佳觀測階段，前中期時間點應處于9:00左右。根尖壓片染色最適染色時長為20 min，并于染色結束后立即用45%的乙酸溶液進行1.5 min的分色，觀察效果更佳。

通過對渥丹百合種子萌發情況的觀察分析發現，種子培養過程中保持水分和無污染，盡可能減少種子的霉菌感染，若出現霉菌感染可能是培養過程中的環境溫度或濕度并非最佳[13]。植物根尖染色體觀測受很多因素的影響，包括根尖培養方式、根尖成熟程度以及制片過程中各個階段的處理技術等[14]。在根尖染色制片過程中發現，有許多幼苗經秋水仙素處理后成為了嵌合體。對于如何解決用秋水仙素誘導處理渥丹百合種子以獲得多倍體中易出現不穩定嵌合體的問題，以及渥丹百合嵌合體的進一步形態學細胞學研究，還需更深層次的研究探索。