蠶絲力學性能的研究進展

鄒邦興， 肖文福， 董思材， 張友洪， 周安蓮， 肖金樹， 郭俊英

(四川省農業科學院 蠶業研究所， 四川 南充 637000)

家蠶是鱗翅目昆蟲的代表，也是主要的經濟昆蟲之一，同時也是用作功能基因分析的重要鱗翅目模式昆蟲，在我國已有數千年的馴養歷史，傳統上以養蠶繅絲織綢為主要用途。因其蠶絲具有輕盈、光滑、柔美的特點為其贏得了“纖維皇后”的美譽。然而在蠶絲制品的開發研究中，蠶絲的機械性能嚴重限制了蠶絲制品的高端開發與應用，與蜘蛛絲相比，蠶絲的拉伸強度、韌性性能較差，主要表現在蠶絲易斷、韌性不夠等。為了克服這一缺陷，廣大學者利用轉基因技術進行了蠶絲機械性能研究，筆者就目前基于基因編輯在蠶絲力學性能上的研究及進展進行概述，并對存在的問題和發展趨勢進行討論。

當前蠶桑行業每況愈下，傳統的栽桑養蠶繅絲織綢模式已不能滿足行業發展需求，為拓展蠶桑行業發展，國內外學者利用蠶絲的生物學特性，開發蠶絲新功能、新用途，進而促進蠶業繁榮發展。然而蠶絲作為紡織材料在應用方面存在斷裂強度低、韌性弱等力學性能方面的不足，因此嚴重限制了蠶絲的高端應用和開發。隨著轉基因技術的發展，目前已經成功將控制蜘蛛絲的基因導入家蠶，并獲得了一系列機械性能強于傳統蠶絲的轉基因素材。但到目前為止，各研究機構所獲得的成果僅限于試驗階段，生產上仍沒有力學性能得到改良的蠶品種，蠶絲用途拓展仍處原地。因此，總結了近10年來蠶絲改良的研究方法及進展，為在今后蠶絲改良方面的研究提供借鑒與參考。

1 基因編輯技術的發展

基因組編輯(Genome Editing)技術作為生命科學技術史發展中的一項突破性技術，實現了針對基因的精準修改，包括基因的插入、缺失或替換等[1]。利用基因組編輯技術可以在基因功能分析和疾病基因治療研究方面具有廣闊應用前景。目前實驗室所用的基因編輯技術主要有第一代基因編輯工具鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、第二代基因編輯工具類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)及第三代基因編輯工具成簇規律間隔短回文重復序列CRISPR (clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)相關核酸酶Cas9(crisprassociatednuclease Cas9)系統(即CRISPR/Cas9 系統)的3種不同基因編輯工具。其中以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術目前在全球各大實驗室得到廣泛應用。

1.1 第一代基因組編輯技術

鋅指核酸酶是一種由鋅指模塊和Fokl核酸酶結構域組成的嵌合蛋白[2-3]。鋅指是普遍存在于轉錄因子中小的天然DNA結構域，DNA識別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯組成(一般3～4個)，1個鋅指可以特異識別3個堿基；鋅指核酸內切酶的特點是Folk需要形成1個二聚體才具有切割DNA雙鏈的酶活性[4]。自從鋅指核酸酶首次在果蠅中成功敲除yellow基因后，先后在斑馬魚、小鼠、豬、家蠶、擬南芥[5-9]等生物體上進行基因修飾，但是編輯效率較低，而且耗時較長，成本較高。

1.2 第二代基因編輯技術

類轉錄激活因子核酸酶是來源于植物病原菌黃單胞桿菌的分泌蛋白，最先由Adam J.Bogdanove團隊和Ulla Bonas[10-11]團隊發現其可以和DNA作用。其后的研究解析了TALEN的DNA結合域的重復可變雙氨基酸殘基(repeat variable diresidues，RVDs)和靶DNA的核苷酸之間有某種一一對應的關系。在發現了TALE的密碼后，研究者將TALE蛋白與核酸酶組合形成了第二代基因編輯工具TALENS。該技術出現后，很快在斑馬魚、小鼠、果蠅、昆蟲[12-15]等動物上成功進行基因修飾。和ZFN相比，TALEN從原來識別3個堿基變成了識別1個堿基，增加了基因編輯的難度，但是后者在設計上比前者簡單，不需耗費大量時間，在靶位點識別上，TALEN的選擇范圍更廣，特異能力更強，靶效率更高。但是這2種方法都是用蛋白質識別目的基因的核酸序列，因此在使用時工作量較大，且編輯效率不高。

1.3 第三代基因編輯技術

CRISPR/Cas最先由NAKATA等[16]在大腸桿菌的iap基因下游發現的1個成簇的29 bp重復序列，隨后在古細菌中也陸續發現，這些重復序列后來被稱為間隔序列(spacer)DNA的非重復短序列。2002年JANSEN和MOJICA將這類短重復序列統稱為CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。CRISPR在不同物種間其位點數量和包含的重復序列存在差異[17]。后來，研究者發現與CRISPR相關的4個蛋白基因(Cas)[18]，此后在廣大科學家[19-25]的努力下，先后在葡萄球菌、嗜熱鏈球菌的CRISPR上進行試驗，發現CRISPR/Cas系統中的Cas9蛋白被gRNA引導切割DNA，這些重要發現，為深入研究CRISPR/Cas系統的作用機制打下了基礎。

與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas系統介導的基因組靶向編輯在原理上是全新的，其靶位點識別由與靶標序列互補的短RNA決定。目前最為常用的CRISPR/Cas系統是僅在細菌基因組中發現的Ⅱ型CRISPR/Cas系統，其工作原理為將CRISPR元件轉錄生成的CRISPR RNA (crRNA ) 和transactivating-CRISPR RNA (tracrRNA) 這2個非編碼RNA改造成一種單導向RNA( single-guideRNA，sgRNA)，sgRNA能夠引導Cas9 蛋白結合并切割靶位點DNA序列[26-27]。

2 基因編輯在家蠶中的應用

隨著基因編輯技術的不斷發展，家蠶作為模式生物，具有飼養周期短、各階段形態特征明顯的優點被國內外廣大學者作為基因編輯技術應用的首選。自夏慶友[28-29]將家蠶全基因組測序及精細圖譜構建以來，蠶絲生物反應器的開發迎來井噴時代，如蠶絲合成與分泌機制研究[30]、變態發育的激素調控研究[31]、性別調控研究[32]以及轉基因家蠶絲腺生物反應器開發等領域[33-34]。與此同時MA[35]和WANG[36]分別利用 TALEN和CRISPR/Cas9系統介導的基因組靶向編輯技術成功實現了對BmBLOS2 基因的定點敲除，并獲得了陽性純合突變體家蠶。隨后，來自日本國立農業生物資源研究所、日本信州大學纖維學部以及浙江大學動物科學學院的研究人員，相繼利用基于TALEN或CRISPR/Cas9系統的基因組靶向編輯技術實現了對家蠶Bm-re[37]、BmFibH[34]和Bm-ok[38]等內源基因的定點敲除。WANG[39]和TAKASU等[40]分別用Golden Gate 組裝體系建立了一套適用于家蠶的TALE 核苷酸骨架組裝的方法，LIU等[41]將sgRNA和Cas9核酸酶表達載體質粒混合導入體外培養家蠶細胞，實現了對家蠶細胞基因組靶位點的精確定點敲除與染色體結構變異操作，并證實CRISPR/Cas9系統具有在家蠶細胞和胚胎中介導實現多基因敲除的潛力。自此，分別由ZFN，TALEN和CRISPPR/Cas9系統這3類介導的基因組靶向編輯技術均已經在家蠶中成功建立并取得應用。

近年來隨著蠶業發展中面臨的問題：土地成本增加、青壯年勞力外出、產業結構調整、行業不穩定等因素制約，傳統蠶桑經營模式已不能滿足產業發展。為了產業轉型升級，將功能單一化的蠶桑業轉為多元化發展，桑果綜合利用、桑葉茶開發、蛋白飼料桑、蠶蛹粉、蠶絲用途研發等蠶桑副產業應運而生，其中圍繞蠶絲新用途的研發較為熱門，根據其生物學特性，轉基因蠶絲不斷在醫學、美容、軍工上取得進展，研究者們成功研制了一批轉基因生物學繭絲材料，主要成果有：TAN[42]等應用轉錄激活因子效應核酸酶介導的同源定向修復，用蜘蛛Nephila clavipes中主要的壺腹蛛絲蛋白-1基因(MaSp1)取代家蠶絲素重鏈基因(FibH)，成功用1.6 kb的MaSp1基因替換了家蠶絲素重鏈中16 kb的內源FibH基因，構建了表達蜘蛛絲纖維的轉基因蠶，并在繭殼中實現了高達35.2%的嵌合MaSp1蛋白量(圖1)。WANG等[43]利用家蠶絲腺多基因生物反應器系統成功將人堿性成纖維細胞生長因子和人轉移細胞生長因子2種重組蛋白同時表達至蠶絲纖維中，建立獲得可以穩定遺傳的新型蠶絲家蠶素材品系，以實現雙生長因子新型蠶絲的高效低成本生產，對拓展蠶絲在組織工程和再生醫學領域中的應用具有重要促進作用。ZHANG等[44]利用蠶絲具有和人類皮膚高度親和的特點，開發了一種絲素蛋白膜，有效地減少了平均傷口愈合時間，具有更好的皮膚再生，該研究提供了系統的臨床前和臨床證據，證明絲素蛋白膜促進傷口愈合，從而為其在臨床中應用皮膚修復和再生奠定了基礎。YERRA[45]研究表明飼喂亞精胺(Spd)可顯著增加纖維長度，進而影響蠶繭的結構，機械和分子水平的絲質量，這可以在絲綢生物材料生產中被利用。與此相應CHENG等[46]通過在家蠶日糧中添加不同物質，發現酪氨酸和絲素蛋白氨基酸顯著增加絲纖維中的鉀含量，誘導α-螺旋和無規卷曲轉變為β-折疊結構，從而產生更高的結晶度和更好的機械性能(圖2)。該發現提供了綠色且有效的方法，用于大規模生產具有高結晶度的機械增強的絲纖維。WANG等[47-48]研究表明，利用轉基因蠶產生的絲具有良好的生物相容性、生物降解性和自組裝能力，為生物醫學應用提供良好材料。 KAWABATA 等[49]開發絲-彈性蛋白聚合物，這種新型材料具有從液體到凝膠的能力，可以應用于難用水溶液處理的各種傷口。筆者將羊毛角蛋白基因轉入到家蠶絲腺中，獲得陽性個體，但經力學性能檢測，其性能并未提高，且比對照低，其原因可能是外源基因難在絲腺內完整表達。這些研究均為蠶絲的利用提供技術支撐方向，為今后蠶業的發展提供選擇。

圖1 轉蜘蛛MaSp1基因蠶絲腺對比

Fig.1 Comparison of silk glands in transgenic spiderMaSp1 gene

圖2 蠶絲天然結構的改變

3 展望

我國是傳統的栽桑養蠶大國，抗戰時期，我國靠著絲綢織物出口創外匯給軍隊提供補給。改革開放初期，絲綢每年占據我國外匯的1/3。而隨著經濟大發展，蠶桑行業采取“東桑西移”的發展戰略，加之近年來農村勞力大量外出，產業結構不斷調整，蠶桑發展面臨嚴重挑戰。傳統的栽桑養蠶繅絲織綢模式已不能滿足當前行業發展的需求，蠶桑行業要繼續發展，必須要開發其他用途，蠶絲作為天然纖維，具有很好的皮膚親和能力，因此可以開發成手術縫合線；絲綢織物具有輕盈特點，可以制作成防彈衣和宇航服。這些都能滿足蠶絲行業的繼續發展，而目前最急需解決的是蠶絲力學性能的改良，因為當前生產上使用的品種均不能完全滿足上述蠶絲特殊用途。

國內外研究者紛紛通過轉基因手段、外源添食方法及理化原理進行蠶絲的生物學性狀改良，以提高蠶絲的力學性能，并取得一系列研究成果，但到目前為止仍然沒獲得可以在生產上應用的改良品種，原因主要有轉基因繭絲素材遺傳穩定性不夠，脫靶效率增加轉基因材料獲取的難度，外源基因與宿主基因存在排斥，導致許多功能性狀好的基因無法植入家蠶體內，外源基因在家蠶體內的表達量不足；實驗室需要從事基礎研究，而許多基礎研究在轉變成成果的過程中又與國家政策存在矛盾，主要體現在公眾對轉基因生物安全問題存在擔憂，因此農業部將轉基因動植物申報列為三大安全性評估內容之一，加大對轉基因品種的制約。這些客觀因素均制約轉基因材料走出實驗室，同時也影響科研人員從事更加深入基礎研究的信念，如何處理好轉基因蠶絲材料的研發和應用將是今后蠶業科研人員長期面臨的問題。針對這種現狀，筆者認為今后的研究應當圍繞市場需求和產業發展趨勢深入開展，在符合轉基因品種安全的條件下加大對家蠶繭絲的基礎研發力度。同時各科研單位之間應加強溝通與合作，開展學術交流，取長補短，避免重復研究。