平面細胞極性通路在神經管缺陷中的作用

黃少勇，蔡潤澤，陳永昌*

(1.昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院，昆明 650500； 2.云南中科靈長類生物醫學重點實驗室，昆明 650500)

神經管缺陷也被稱作神經管畸形(neural tube defects，NTDs)，其發病率僅次于先天性心臟病，是最常見先天性畸形[1]之一，通常是由于胚胎發育早期神經管閉合不完全或者不閉合造成的。NTDs一旦發生則不可逆轉，多在孕期流產或出生后很短的時間內死亡[2]。目前，盡管已有神經管缺陷的產前診斷方法，但是全球每年有超過30萬的NTDs嬰兒出生，而患有NTDs的嬰兒有較高的死亡率，十分之一患有NTDs的嬰兒會在第一年死亡[3]。神經管畸形可分為無腦兒(anencephaly)、腦膨出(encephalocele)、脊柱裂(spina bifida)和顱脊柱裂(craniorachischisis)等幾種類型。NTDs在全世界范圍內的發病率已經達到0.5‰～2‰[4]，并且在不同的地區發病率也有著較大的差別。神經管閉合依賴于肌球蛋白收縮的細胞運動過程例如根尖收縮，組織和細胞定向重排等過程[5]。NTDs的發生不僅受遺傳因素影響，也受到環境因素共同影響，目前常用補充葉酸(folic acid，FA)的方法來預防神經管缺陷的發生，妊娠前和妊娠早期補充適量的葉酸可以降低60%～70%的NTDs的發生[6]。此外，體外胚胎干細胞分化過程中也發現葉酸對神經分化具有促進作用[7]。因此，在對神經管畸形的發生及其致病機制的研究中，大部分研究的焦點主要集中在葉酸代謝通路及其相關基因，但補充葉酸只能預防NTDs并不能阻止它的發生且葉酸預防NTDs發生的具體分子機制尚不清楚[7]。了解研究神經管缺陷的致病機制有助于人們對NTDs的治療。近年來科學家通過對小鼠、非洲爪蟾等神經管畸形動物模型的研究表明，平面細胞極性(planar cell polarity，PCP)信號通路在神經管閉合的過程中起著很重要的作用，PCP信號通路及其相關基因也成為研究神經管畸形遺傳基礎的熱點之一。因此，建立合適的動物模型對了解神經管缺陷的致病機制，進而更好地研究預防和治療NTDs至關重要。

1 PCP信號通路

神經胚的形成是胚胎發育中的一個基本過程。神經胚的發育影響神經管的發育，而大腦和脊柱的前體是神經管[8]。神經管是在胚胎發育過程中由大腦和脊髓的中樞神經形成的一個瞬態結構[7]。神經管的閉合是由神經板的折疊、升高、結合、在背側中線處融合，從而形成神經管[9]。在這一過程中的任何一個步驟發生中斷就會導致NTDs，例如脊柱裂、無腦兒、無腦畸形和顱脊柱裂[7]。因此在神經管閉合的過程中每一步都顯得至關重要，而在整個過程中PCP信號通路有著關鍵作用。PCP信號通路也被稱為非典型Wnt信號通路，它調節與基底垂直的上皮片的極性[10]。最早在果蠅中發現PCP信號通路，其影響果蠅翅膀體毛排列和復眼等高度有序化結構的形成[11]。在哺乳動物中，節點纖毛的定位以及內耳的纖毛和皮膚上的毛囊中都發現了PCP信號通路的存在[12]。Adler等人[13]的研究表明，PCP信號通路在進化上非常保守。PCP核心蛋白會形成一個比較復雜的膜復合體，這些蛋白質的數量和亞細胞分布對胚胎發育中原腸胚的形成以及神經胚形成過程中的PCP信號通路成員的匯聚延伸(convergent extension，CE)發揮著重要的作用[14]。CE是指在原腸胚形成的后期，神經管在后腦與頸部交界的區域閉合，神經管的閉合要求底板細胞群向中線匯聚延伸的一個過程[15]。CE是由非典型Wnt/Frizzled信號通路控制。與典型Wnt信號通路不同的是，非典型Wnt信號通路是通過β-actin穩定的控制細胞的命運，即果蠅中PCP通路[16]，而且CE這一過程的發生是由細胞的極化重排驅動的[17]。因此PCP通路驅動CE讓細胞發生重新形成神經板，SHROOM3、VANGL2和WNT5A基因通過改變細胞形態使神經板折疊直至神經管閉合形成。

2 PCP通路的相關基因

PCP通路包括以下6個核心基因：FRIZZLED(FZ)，DISHEVELLED(DSH/DVL)，STRABISMUS/VANGOGH(STAM/VANGL)，FLAMINGO(FMI)/CELSR，PRICKLE(PK)和DIEGO(DGO)等[20]。果蠅FZ基因在多年前就被發現能調節平面極性[21]，而且FZ蛋白參與了幾乎所有的Wnt信號通路。但不同的FZ蛋白參與不同的通路，在中樞神經中神經軸突的生長以及方向定位中就有FZD3蛋白在發揮著作用[22]。DSH基因是Wnt信號通路的關鍵組成部分，可能也有其他的功能，DSH是Wnt信號的關鍵因素，這些信號來源于Wnt受體家族，即卷曲蛋白。DSH能指揮來自于細胞質膜的信號進入正確的細胞內通路[23]。VANGL基因是PCP通路中第一個確定與人類NTDs有關的基因，并且有VANGL1和VANGL2兩個亞型。非洲爪蟾同源人類VANGL1和VANGL2負性調節Wnt β-catenin信號通路，編碼Wnt受體β信號通路負調控基因的功能突變會導致腫瘤發生[24]。FMI基因也是在果蠅中發現的，并且與PCP通路相關，FMI基因在果蠅的神經系統發育中起著很重要的作用[25]。Chen 等人[26]對184例中國NTDs病人的基因分析，他們發現3個CELSR基因(CELSR1,CELSR2 和CELSR3)發揮重要作用，這3個基因的突變會導致NTDs患病的風險大大增加。PK基因在細胞層影響VANGL1的不對稱動力學，因此，PK基因控制自己的定位與VANGL1產生共同的影響[27]。DGO蛋白在脊椎動物上的同源物是DVL，而DVL與Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路都有關[28]，目前在NTDs上研究不多，這些基因都是與PCP信號通路有關。還有一些基因在神經管閉合這一過程中也起著比較重要的作用，例如SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等[7]發現在PIP5KL缺失的小鼠中，神經管閉合有缺陷，而且神經上皮排列混亂。

3 PCP信號通路與NTDs

已知PCP信號通路核心基因對NTDs的重要性，但除此之外，還有許多基因也對神經管的閉合有著很重要的作用，例如：SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等人[7]發現在PIP5KL缺失的小鼠中，神經管閉合有缺陷，而且神經上皮排列混亂。下面對SHROOM3，VANGL2和WNT5A這三個基因是如何影響PCP信號通路，進而導致NTDs的發生進行闡述。

Jeffrey等[29]對小鼠的SHROOM3基因研究發現，SHROOM3基因的嚴重突變會導致嚴重的大腦畸形。因此，SHROOM3基因可能對神經管閉合過程中是一個關鍵的因素。在大多數脊椎動物中它SHROOM3基因的正常表達是神經管形成的必要因素，該基因在進化上是保守的。在該研究中，SHROOM3基因的功能的喪失會導致小鼠發生無腦畸形、腦膨出、脊柱裂等畸形，說明神經管閉合失敗。其原因是SHROOM3的功能喪失會使神經折疊結構向外部擴展而不能在背側中線處匯合成。SHROOM3編碼一個PDZ結構域的蛋白質，并且從多層次來調節細胞結構。首先，內源性SHROOM3蛋白黏附于細胞骨架上；第二，局部表達的SHROOM3蛋白改變纖維肌動蛋白的分布，并且該蛋白質可以與纖維肌動蛋白結合；第三，SHROOM3蛋白直接結合肌動蛋白；最后，神經上皮的細胞骨架會影響突變體的胚胎[30]。SHROOM3基因的缺失會阻斷神經胚的形成，導致神經管閉合失敗，由此引發的神經管閉合缺陷并不能通過葉酸補充來預防，反而大劑量的補充會增高死亡率。目前，SHROOM3基因在胚胎發育過程中發揮功能的機制尚不清楚。除了SHROOM3基因之外，Chen和他的團隊[31]對NTDs的病人研究發現，SHROOM2基因的突變會破壞PCP信號通路，進而改變細胞骨架后重塑導致NTDs風險增加。

VANGL2基因是1988年Taylo[32]在從果蠅的基因組發現的，根據表型不同，最先發現的基因而被命名為STBM或VANGL2。隨著研究的深入，Kibar和他的同事[33]推測人類的NTDs由VANGL1及VANGL2基因突變引起的，這兩個基因在小鼠中與平面細胞極性有關。在NTDs患者中發現了很多種VANGL2基因突變，證實了NTDs的發生與VANGL2基因有密切的關系[34]。在脊椎動物的早期胚胎發育過程中，CE驅動胚胎軸和神經板的收縮和延長。在幾種模式生物的原腸胚中，VANGL2在CE過程中起著決定性的作用[35]。Park等人[36]發現在爪蟾胚胎中過表達VANGL2能夠抑制CE的發生。如果在這一過程中VANGL2基因發生嚴重突變，可能導致高度組織特異性的上皮結構失去正常的極性，從而導致不同程度的神經管缺陷的發生。Gabriel L Galea和他的團隊[37]在VANGL2突變的純合小鼠中發現，VANGL2的突變阻止了小鼠神經管的正常閉合，導致了NTDs的發生。因此，闡明VANGL2基因在神經管閉合的過程中的分子作用機制，才能有效的預防或者阻止NTDs的發生。

1999年，Yamaguchi等[38]發現WNT5A基因的缺失會導致胚胎在發育過程出現差錯從而導致新生兒的死亡。Shimizu[39]發現，在果蠅中WNT基因作用于PCP信號通路的上游。Wnt信號通路非常保守，且與神經管畸形密切相關。Kimura-Yoshida等[7]發現Wnt信號調制器DKK1和KREMEN1定位在神經板邊界。Kilian等人[40]發現WNT5A是后內胚層如脊索中CE過程所需要的。Mcgreevy等[41]發現WNT5A是PCP通路中的一個配體，在WNT5A敲除的小鼠中呈現特有的CE過程，WNT5A和SHROOM3在遺傳上是相互作用的。2017年對小鼠的研究發現，PCP通路的一些組分會調節WNT5A，使皮質脊髓軸突成長成圓錐細胞[5]。

4 NTDs動物模型

NTDs的致病原因相當復雜，與單基因控制的疾病不同，遺傳因素和環境因素共同作用于NTDs。在遺傳因素中，雖然發現了許多基因與神經管閉合有關，但是這些基因具體如何發揮作用導致NTDs尚不清楚。建立合適的動物模型是探究相關基因及信號通路、營養因素等與NTDs相關性的重要手段。

表1 主要NTDs動物模型及相關基因

有關NTDs代表性動物研究模型構建見表1。從表中我們可以得出目前大部分研究NTDs的動物模型都集中在小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚等低等模式動物。因為NTDs的發生是在神經發育早期發生的，用其他的模式動物很難觀察到神經管閉合的過程。而上述三種動物模型則可以很清楚和直觀的觀察到神經管閉合過程中的變化，并且敲除這些動物的與NTDs相關的基因很容易實現，因此很多科學家用這些動物來研究NTDs。在這些研究模型中，很多研究的基因是PCP信號通路中的主要基因，也有其它一些重要基因如SHROOM3，TRPM6，和PAX3等基因。在表中的這些基因都與神經管閉合的過程中的PCP信號通路以及CE過程有著很重要的關系。由于基因編輯技術的發展，這些動物模型的建立更加容易，但是也存在一些局限性。小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚的大腦發育有著很大的差別，一些基因表達的時間和空間也不盡相同。對于人類NTDs來說，這些模式動物的大腦發育和人類大腦發育有著天壤之別。在這些模式動物中，某些與NTDs相關基因的突變可以導致它們發生神經管閉合不全，但是這些結果不一定在人類上可以發生。由于非人靈長類動物的大腦和人發育的相似度很高，所以研究人類疾病的動物模型非人靈長類動物是最好的選擇。但是由于嵌合體的問題，在非人靈長類動物上產生人類NTDs有著很大的難題。因此，研究與人類大腦發育及其相似的非人靈長類動物模型迫在眉睫。

5 問題與展望

本文通過SHROOM3，VANGL2和WNT5A三個基因來闡明PCP信號通路在神經管缺陷中的一些作用和和分子機制。在正常的發育過程中，細胞表達SHROOM3蛋白，產生的蛋白使細胞呈楔型，并且變長，引起神經板卷曲。還有一些細胞如附近的皮膚和表皮細胞等，則推動和形成折疊，從而促使神經管的閉合。VANGL2基因參與了CE這個過程，而CE又是PCP信號通路的一個重要組成部分，因此VANGL2基因的突變也會導致神經管的閉合不全。而WNT5A基因作用與PCP信號通路的上游來參與神經管閉合這一過程，但是WNT5A基因突變不一定會導致神經管缺陷的發生。

目前世界各國采用給育齡婦女補充FA來預防NTDs的發生，雖然達到了一定的預防效果，但還是不能阻止NTDs的發生。問題在于NTDs的致病原因復雜，而且與之相關的基因較多。補充葉酸可以預防由VANGL2基因突變導致的NTDs，但是還有很多基因的突變導致的NTDs是葉酸所不能預防的。近年來，很多科學家都投入到研究NTDs的工作中，雖然取得了很大的成功，但是離治療還有很大一段路要去探索。目前研究的NTDs的動物模型只有小鼠，大鼠和斑馬魚等模式生物，這些動物模型只能幫助了解和探索NTDs的發病機制和作用機理。但是，這些動物模型與人類的發育有著很大的差別，因此建立非人靈長類NTDs模型至關重要，而且一個成功的NTDs非人靈長類動物模型對發現新的治療方法和預防NTDs的發生有著十分重要的意義。