超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中的阿托品

林奕云，楊 熙，林 晨，張志軍，張 飛

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

阿托品是一種M膽堿受體阻斷藥，具有解除平滑肌的痙攣、抑制腺體分泌、解除迷走神經對心臟的抑制、興奮呼吸中樞等藥理活性，在獸醫臨床上主要作為解毒藥，緩解有機磷中毒的癥狀[1]。我國農業部第235號公告規定，在動物源食品中不得檢出阿托品。但有一些部分商家在牛飼養過程中擅自使用阿托品注射藥物，利用其抑制腺體分泌的作用，使牛因口渴而大量飲水，從而增加體重,以謀取更多的經濟利益。

目前阿托品的檢測方法有：氣相色譜法[2]、液相色譜法[3-5]、液相色譜-串聯質譜法[6-9]等。由于獸藥殘留的含量較低，液相色譜法靈敏度無法滿足其檢測要求。質譜法具有靈敏度高、專屬性強的特點，為有效監控牛肉中阿托品的殘留量，本文優化了提前條件、液相色譜和質譜條件，建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-MS/MS)法測定牛肉中阿托品殘留量的分析方法。該方法靈敏度高、回收率和重現性良好、結果準確可靠，可以檢測牛肉中阿托品殘留量，為注水牛肉的監管提供技術手段支持。

1 實驗部分

1.1 儀器設備與試劑

Agilent 1290/6460A超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，美國安捷倫科技公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司；KQ-2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Sartorius BSA224S 電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

阿托品(Atropine，CAS：51-55-8，純度：99.6%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈，色譜純，美國Honeywell公司；甲酸，色譜純，美國Tedia公司；甲醇，廣州化學試劑廠；磷酸二氫鉀，廣州化學試劑廠；實驗用水為去離子水。

1.2 標準溶液配制

準確稱取10.0 mg阿托品標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

樣品均質處理后，稱取5.0 g于50 mL帶蓋離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液，加蓋，渦旋2 min，超聲提取15 min，3500 r/min離心5 min，上清液倒入另一干凈離心管中。殘渣再加入20 mL 0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液，重復提取一次，合并兩次上清液。用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：乙腈(4∶1)溶液4 mL洗滌濾紙，將上清液用濾紙過濾，收集全部濾液于50 mL容量瓶中，定容至50 mL，過0.22 μm濾膜上機測定。

1.4 基質匹配標準曲線的配制

稱取5份空白試樣，分別加入適量標準溶液，按照1.3進行處理，制成濃度為0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 ng/mL的基質匹配標準工作液。

1.5 色譜/質譜測定條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5.0 μL；梯度洗脫程序如下：0～1 min，20%A，1～3 min，20%～30%A，3～3.5 min，30%～90%A，3.5～4 min，90%～20%A，4～5 min，20%A。

1.5.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正離子電離模式，掃描方式為多反應監測模式(MRM)。鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量11 mL/min，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流量5 mL/min，霧化器壓力40 psi，毛細管電壓3500 V。阿托品的MRM參數列于表1，安捷倫MassHunter軟件用于定性和定量分析。

表1 阿托品的MRM參數

注：*表示定量離子對。

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

基于阿托品是堿性物質，具有易溶于水的性質，本試驗比較了0.1%甲酸水溶液和0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液對阿托品提取回收率的影響，結果表明，用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液提取，阿托品的回收率較高。由于乙腈對蛋白質具有一定的沉淀作用，本試驗比較了0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液和乙腈的不同比例對阿托品提取效果的影響，結果發現，隨著乙腈的比例增加，阿托品的回收率降低，當0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液為4∶1時，阿托品的提取回收率最高，沉淀蛋白等雜質的效果好，共萃物較少。因此，選用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液(4∶1)作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優化

分別以乙腈-水、甲醇-水作為流動相，考察對目標化合物離子化程度的影響。結果表明，以乙腈-水作為流動相時，阿托品的響應值明顯高于流動相為甲醇-水時的響應值。因此，選用乙腈-水作為流動相。

目標化合物的離子化效率還會受到流動相中加入的添加劑影響[10]。比較在水相中分別加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨對目標化合物離子化效率的影響。結果發現，在流動相中加入少量甲酸有利于目標化合物的離子化，能促進生成[M+H]+離子，提高了阿托品的響應值和檢測靈敏度。因此，試驗采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，梯度洗脫。

2.3 質譜條件的優化

使用1.0 μg/mL阿托品標準溶液進樣，分別在ESI+、ESI-的模式下進行全掃描，掃描發現在正離子模式下，阿托品的靈敏度更高，因此，選擇擇正離子模式，m/z 290.1作為阿托品測定的母離子。采用SIM掃描方式，優化出最佳碎裂電壓，100 V條件下，阿托品母離子的響應最高。再采用Product Ion掃描方式，阿托品經碰撞后產生的碎片離子有m/z 93.0 和m/z 124.0，其中m/z 124.0相對豐度最高，作為定量離子，m/z 93.0作為定性離子。最后，優化出子離子的最佳碰撞能量，得到表1所示的質譜參數。最終優化了質譜條件，得到如圖1所示的阿托品標準溶液的MRM色譜圖，如圖2所示的陽性樣品和陰性樣品的總離子流TIC圖。

圖1 阿托品的多反應監測(MRM)色譜圖

Fig.1 MRM Chromatograms of Atropine

圖2 樣品的總離子流(TIC)色譜圖

2.4 線性范圍

本文采用基質匹配外標法定量，以消除基質干擾，提高定量準確性。按照1.4配制基質匹配標準曲線，以阿托品的質量濃度(x)為橫坐標，色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制工作曲線。結果表明，阿托品在0.10～5.0 ng/mL的質量濃度范圍內線性回歸方程為Y=78036X-2015.2，相關系數r≥0.999，具有良好的線性關系，表明該方法適用于牛肉中阿托品的定量分析。

2.5 檢出限和定量限

阿托品的檢出限為0.5 μg/kg(信噪比S/N=3)，定量限為1.5 μg/kg(信噪比S/N=10)。

2.6 回收率和精密度

準確稱取3份空白樣品，每份5.0 g，加入阿托品標準溶液，添加量為1.0、5.0、10 μg/kg，按照1.3方法進行樣品處理。每個添加水平測定6次，考察方法的精密度。從表2可以看出，在1.0、5.0和10 μg/kg這3種加標水平下目標化合物的平均回收率為89.5%～95.2%，相對標準偏差(RSD6)為2.07%～5.03%，表明方法的準確度和重復性較好，可滿足日常分析要求。

表2 阿托品的回收率和相對標準偏差(n=6)

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中阿托品殘留量的分析方法，樣品用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈(4∶1)溶液提取，基質匹配外標法定量，降低了基質干擾，提高了分析靈敏度。該方法樣品前處理操作簡單，靈敏度高、回收率和重現性良好、結果準確可靠，可用于檢測牛肉中阿托品的殘留量，為注水牛肉的風險監測提供技術手段支持。