人凝血因子7a核酸適配體的篩選與鑒定

羅鈺 王騰飛 李文靜 王金娥 裴仁軍

摘?要?人凝血因子7a （FVIIa）是外源性凝血途徑的核心因子，檢測參與凝血過程的FVIIa及針對FVIIa開發安全有效和經濟的凝血劑和抗凝血劑是具有重要的意義。本研究基于指數富集配體系統進化技術 （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），采用酸纖維素膜法，通過11輪篩選成功分離出FVIIa的DNA適配體，并模擬了其二級結構。此適配體與FVIIa蛋白結合的表觀解離常數為102 nmol/L。同時，基于所獲得的高親和力適配體，建立了基于適配體的熒光檢測方法。本方法簡單高效，對FVIIa蛋白的定量檢測范圍達到30～80 nmol/L，為人凝血因子7a的檢測提供了一條新途徑。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和適配體的熒光檢測方法結果表明， 此適配體具有良好的選擇性。

關鍵詞?凝血因子7a; 適配體; 指數富集配體系統進化技術; 篩選; 熒光檢測

1?引 言

經典凝血假說認為，在高等生命體中的凝血機制存在兩個啟動過程，分別是內源性凝血和外源性凝血 [1]。在正常的凝血過程及各種血栓性疾病中，凝血過程通過激活外源性途徑觸發。外源性凝血由凝血因子7a（Factor VIIa，FVIIa）與組織因子（Tissue factor，TF）形成的復合物引發[2，3]。FVIIa是一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，在缺乏組織因子的情況下，對大分子底物的活性較低[4]。TF-FVIIa復合物的形成為大分子底物提供了一個合適的結合面，并通過改變FVIIa的活性位點提高其催化性能[5，6]。經過一系列反應，TF-FVIIa復合物通過外源性凝血途徑最終促成纖維蛋白凝塊的形成，參與凝血[7]。盡管此凝血途徑的作用機制已被闡明，但現有技術對診斷和治療由各凝血因子障礙而引起的血液疾病仍存在明顯不足。因此，檢測參與凝血過程的各因子，并針對特定疾病開發安全有效和低成本的凝血劑和抗凝血劑，仍然是一個亟待解決的問題。

適配體是通過指數富集配體系統進化技術 （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 在體外篩選獲得的一種單鏈核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，對其相應的靶標具有高親和力和高選擇性[8～11]。作為一種功能化核酸，適配體可用于對靶標分子的識別[12]。目前，很多適配體序列已被成功分離，相應的靶標包含小分子[13]、蛋白質[14]、細胞系[15]、病毒[16]等。有多種方法被用于篩選蛋白靶標，如親和色譜柱法 [17]、磁珠法[18]、硝酸纖維素膜法[19]等。由于適配體具有高靈敏度、高特異性的特點，基于適配體的傳感器近年也得到了迅猛發展[20，21]。目前，已發展出可用于小分子檢測[13，22]、蛋白分子檢測[23]、細胞成像[15，24]?等的適配體傳感器。

本研究以外源性凝血途徑的核心因子FVIIa為靶蛋白，基于硝酸纖維素膜分離的篩選方法，成功分離出FVIIa的DNA適配體，此適配體與FVIIa蛋白結合的表觀解離常數為102 nmol/L，并具有較好的選擇性。基于所獲得的高親和力適配體，建立了一種簡單的熒光傳感方法，用于檢測FVIIa蛋白。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Eppendorf Mastercycler Nexus PCR儀（德國Eppendorf公司）; VICTOR×4酶標儀（美國PerkinElmer公司）; 電泳儀（美國BioRad公司）; LAS 4000 mini凝膠成像系統（日本Fujifilm公司）。

人凝血因子 7a蛋白由諾和諾德中國研發中心周蓉博士提供; ?DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）; 0.45-μm硝酸纖維素膜（通用電氣醫療系統貿易發展（上海）有限公司）; 25-mm 可拆卸濾器（默克密理博實驗室設備（上海）有限公司）; 鏈霉親和素瓊脂糖微珠、SYBR Green Ι（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）; 10×PCR緩沖液、脫氧核苷三磷酸（dNTPs）、rTaq 聚合酶、20 bp DNA Marker、6×DNA上樣緩沖液、PMD18-T載體克隆試劑盒（寶日醫生物技術（北京）有限公司）; 工程化大腸桿菌 BL21 （美國模式培養物集存庫）; 10×PBS緩沖液、5×TBE緩沖液、鮭魚精DNA、LB液體培養基（干粉）、LB固體培養基（干粉）、30% 丙烯酰胺、10% 過硫酸銨、四甲基乙二胺（北京索萊寶科技有限公司）; 瓊脂糖、NaOH、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、MgCl2、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、Na2CO3、NaHCO3（西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司）。所用試劑均為分析純， 實驗用水為超純水。

2.2?實驗方法

2.2.1?溶液配制?結合緩沖液為1×PBS， 5 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/mL牛血清白蛋白， 25 μg/mL鮭魚精DNA。儲備溶液為2×結合緩沖液。各溶液配制后于20℃保存。

洗脫緩沖液含7 mol/L 尿素、7 mmol/L 十二烷基硫酸鈉和1 mmol/L 乙二胺四乙酸。儲備溶液為1×洗脫緩沖液。配制后于4℃保存。

純化液為鮭魚精DNA、乙酸鈉和無水乙醇的混合液： 準確稱取20 mg 鮭魚精DNA、12.30 g NaAC溶于50 mL水中，并用乙酸調節至pH 5.2，以無水乙醇定容至500 mL，混勻，于20℃保存。

包被液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6），封閉液為3%（w/V））牛血清白蛋白溶液。

2.2.2?篩選過程?（1）負篩選過程?取100 μmol/L 隨機寡核苷酸庫20 μL 溶于50 μL水中，95℃水浴加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結合緩沖液，輕微振蕩搖勻。室溫下與純凈的硝酸纖維素膜共孵育1 h，棄膜，收集上清液，用于后續正篩選。（2）正篩選過程?將上述處理過的隨機寡核苷酸庫與200 μL人凝血因子7a 蛋白溶液于室溫下共孵育1 h。將硝酸纖維素膜固定在可拆卸濾器中，使用1×結合緩沖液潤濕濾器中的硝酸纖維素膜，使共孵育液緩慢的通過硝酸纖維素膜，此過程重復5次。使用800 μL 1×結合緩沖液緩慢洗去游離在膜表面的寡核苷酸序列，此過程重復3次。（3）變性?將硝酸纖維素膜取出并將其剪碎，轉移至1.5 mL 離心管中。加入200 μL 洗脫緩沖液，充分振蕩。95℃水浴加熱10 min，使蛋白變性，與寡核苷酸分離。此過程重復2次，合并兩次洗脫液。（4）純化?加入1 mL純化液，80℃ 靜置2 h。4℃ 下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預冷乙醇，重復離心1次，棄上清液，65℃ 烘箱中烘干。（5）擴增?將干燥的寡核苷酸粉末用150 μL水溶解。每個PCR反應體系為50 μL，每個反應體系含有400 μmol/L dNTPs、1 μmol/L 正向引物、1 μmol/L 反向引物、25 U/mL rTaq聚合酶、5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL DNA模板，總反應體系6 mL; 將PCR程序設置為： 95℃ 5 min; 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s（將此步設為10～20個循環）; 72℃ 5 min; 10℃ 保持至結束。將PCR產物進行凝膠電泳以檢驗產物純度，取 8 μL PCR 產物與 2 μL 6×DNA電泳緩沖液（每 mL 含有 SYBR GReen I 10 μL）混勻后上樣，凝膠為3%非變性瓊脂糖凝膠，電泳緩沖溶液為1×TBE緩沖液，電壓為140 V。電泳結束后利用凝膠成像系統對其拍照并分析。（6）制備單鏈?將PCR產物與鏈霉親和素修飾的瓊脂糖親和柱孵育，由于PCR使用生物素標記的反向引物，利用生物素和親和素的相互作用將PCR產物固定在親和柱上。用800 μL 1×結合緩沖液洗3次后，用0.1 mol/L NaOH溶液洗脫ssDNA，并用適量HCl中和NaOH。加入1 mL 預冷無水乙醇，80℃靜置2 h。4℃下14000 r/min 離心25 min。棄上清液，加入1 mL 70%（V/V）預冷乙醇; 重復離心1次，棄上清液，65℃烘干。將干燥的寡核苷酸粉末用20 μL水溶解，取1 μL稀釋至50 μL，測定260 nm處的吸光度，計算其中寡核苷酸含量。重復步驟（1）～（6）。自第二輪篩選開始寡核苷酸隨機文庫的用量降至300 pmol。

2.2.3?測序與序列分析?擴增經過數次篩選的富集庫，轉入工程化大腸桿菌BL21中， 37℃ 培養過夜; 挑取隨機菌落并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

利用序列比對程序對所得序列進行分析，如 ClustalX 1.83 比對序列，分析適配體序列的一級結構及其同源性，將各序列分組，并用 NUPACK 模擬其二級結構，選擇結構具有代表性的序列進行合成，以進行后續分析。

2.2.4?熒光測量?將96 孔ELISA酶標板用200 μL 1×結合緩沖液預先潤洗1次，孔中包被100 pmol靶蛋白溶液（1 μmol/L， 100 μL，使用包被液稀釋），或等量對照蛋白（牛血清白蛋白和鏈霉親和素），4℃ 下濕盒中過夜，棄去蛋白溶液。在包被蛋白的孔中加入封閉液，37℃孵育2 h; 將50 μL FITC修飾的隨機文庫或適配體序列在95℃水浴中加熱5 min，取出冷卻至室溫，加入50 μL 2×結合緩沖液，混勻后加入處理過的酶標板中，37℃下孵育2 h; 用1×PBS洗去游離的DNA，使用酶標儀讀取（底讀）實驗孔在485 nm處熒光強度。

2.2.5?非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳?將100 pmol 靶蛋白（20 μmol/L， 5 μL） 與 200 pmol （200 μmol/L， 1 μL） 已預先退火的熒光標記的適配體鏈混勻，加入4 μL 2×結合緩沖液，室溫下孵育1 h， 同時設置空白對照及牛血清白蛋白和鏈霉親和素作為陰性對照。孵育后加入2 μL 6×DNA上樣緩沖液，混勻后上樣。凝膠為8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠，電泳電壓80 V。電泳結束后利用凝膠成像系統對其拍照并分析。

2.2.6?統計學分析?采用Origin Pro 8.5 軟件進行統計學分析，兩組間差異分析采用t檢驗， 組間多樣本均數比較采用單因素方差分析。

3?結果與討論

3.1?篩選方法

本研究選擇硝酸纖維素膜分離方法用于篩選靶蛋白FVIIa的DNA核酸適配體。在篩選過程中，先使蛋白與核酸文庫在緩沖溶液中孵育，再依靠膜對蛋白的吸附作用分離有作用的DNA序列。這種先孵育再分離的方法使得蛋白與適配體的結合在液相均相中進行。

硝酸纖維素膜對蛋白的吸附作用使得適配體-蛋白復合物保留在膜表面，再用緩沖液洗去游離在膜表面的未結合的序列，留存在膜上的DNA經過提取純化后，進行PCR擴增，進入到下一輪篩選中。

采用熒光法監測篩選過程中庫的富集效果。FITC標記的核酸庫由FITC標記的正向引物通過PCR反應制得。如圖1所示，隨著篩選輪數的增加，保留在蛋白表面的序列增多，熒光強度增強。經過11輪富集，熒光強度不再發生明顯增長，因此對第11輪文庫進行測序。

3.2?測序結果

經第11輪篩選的文庫被轉入工程化大腸桿菌BL21中，培養過夜后，挑取隨機單克隆菌落進行測序。對測序結果進行同源性分析，結果如圖2所示。將所獲得序列通過M-fold （http：//unafold.rna.albany.edu/） 做二級結構模擬，合成有一定同源性且二級結構相對穩定的序列，并做進一步分析。如圖3所示， 選擇FVIIa-7和FVIIa-16， 并在5'端標記FITC， 以進一步考察親和力和特異性等，FVIIa-7和FVIIa-16的二級結構如圖3所示。相關寡核苷酸序列見表1。

3.3?親和力測定

通過熒光法測定適配體的親和力（解離常數）。先將靶蛋白固定在酶標板上，再使之與熒光標記的適配體作用。除去游離在表面的適配體，可檢測的熒光信號全部來自與蛋白作用的適配體，熒光信號越強，說明與蛋白作用的適配體越多。本方法操作簡單，所需試劑種類及數量較少，是一種簡單經濟的表征方法。如圖4所示，配制終濃度為0、10、25、50、75、100、125、150、200、300、400和500 nmol/L的適配體（每孔100 μL）與靶蛋白作用，按公式（1）擬合，解離常數（Kd）計算結果由Graphpad Prism 5給出：

其中， F為加入適配體后的熒光信號，F0為背景信號， c為所加入適配體的濃度， Fmax為擬合曲線Y軸上最高點， Kd為所求的解離常數。

FVIIa-7的解離常數為296.3 nmol/L（圖4A），而FVIIa-16具有更高的親和力，解離常數為102.0 nmol/L（圖4B）。

3.4?FVIIa的定量檢測

采用競爭結合法確定FVIIa-16對靶蛋白的檢測濃度范圍。

實驗原理如圖5所示，在溶液相中加入不同量的蛋白，與適量的適配體孵育，再將含有蛋白-適配體復合物、游離蛋白、游離適配體的混合溶液加入到包被了FVIIa蛋白的酶標板中，通過測定與酶標板上固定蛋白結合的適配體發出的熒光信號，間接反映待測溶液中FVIIa蛋白的濃度。

首先在酶標板中包被100 pmol靶蛋白，將終濃度為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、200和300 nmol/L 的靶蛋白與200 pmol已變性處理的適配體在結合緩沖液中 （總體積100 μL）于 37℃孵育1 h，將溶液依次轉移至包被有蛋白的酶標板中，37℃下孵育2 h; 洗去游離的DNA，測定各孔在485 nm 的熒光強度。如圖6所示，適配體對FVIIa-16定量檢測范圍為30～80 nmol/L，線性回歸方程為 ΔF485 nm=-6.18C （nmol/L） + 602.27（R2=0.978）。

3.5?方法的特異性

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳考察適配體的特異性 [18]，如圖7所示，熒光標記的適配體與FVIIa結合后，相比于對照組蛋白條帶滯后。利用熒光法檢驗了熒光標記的適配體與FVIIa及對照組蛋白間的作用，酶標板中每孔包被100 pmol蛋白，與300 pmol 已變性處理的適配體孵育，記錄其熒光強度; 基于t檢驗計算同種蛋白組間顯著性差異，結果如圖8所示，空白對照組為不加適配體的蛋白本底熒光值，樣品組為加入熒光標記適配體的響應值，結果表明，FVIIa-16能顯著區分靶蛋白的空白對照與樣品組，而不與其它對照蛋白作用，具有良好的特異性。

4?結 論

采用硝酸纖維素膜法，經過11輪篩選，成功篩選分離了人凝血因子FVIIa的DNA適配體。此適配體的表觀解離常數為102.0 nmol/L，對FVIIa定量檢測范圍為30～80 nmol/L，具有良好的選擇性。FVIIa蛋白的RNA適配體已被成功分離，此適配體可通過阻止TF-FVIIa復合物的形成影響FVIIa，并延長凝血時間[25]。但RNA成本高，并需要嚴格的使用環境。DNA適配體成本較RNA適配體低，合成簡單，并具有更好的穩定性。本研究篩選的DNA適配體與FVIIa有較高的親和性，可用于FVIIa的高靈敏、高選擇性的檢測，并有望基于此適配體開發經濟有效的凝血劑或抗凝劑。

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