上調miR-126表達對白血病K562細胞增殖及凋亡的影響

丁 倩,楊 敏

貴州省人民醫院血液內科 貴陽 550002

慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是骨髓造血干細胞惡性增生形成的血液惡性腫瘤，患病率在兒童和青少年惡性腫瘤中高居第一位[1]。在過去二十年中，高效抗腫瘤藥物方面的研究取得了重大進展，然而，化療耐藥及嚴重的毒副作用仍然制約著CML化療[2]。分子靶向治療CML具有明顯的優勢，并且對所有類型的白血病都有效[3]。因此積極探索新的治療靶點有助于改進CML的治療。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一組非編碼小分子RNA，其在細胞生理活動中起著重要的調節作用，如細胞生長、分化、增殖和凋亡等[4]。CML患者和健康對照miRNA表達譜對比分析結果表明，一些miRNA的異常表達與CML細胞的異常增殖密切相關[5-6]。最近研究[7-9]表明，miR-126在多種癌組織中表達下調，如乳腺癌、卵巢癌和白血病。miR-126能夠抑制肝癌細胞生長，誘導細胞凋亡[10]。我們研究了miR-126對人髓系白血病K562細胞增殖和凋亡的影響，并對其作用機制進行了初步探討，以期為白血病診斷和治療靶點的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料K562細胞購自中國科學院上海細胞庫； RPMI 1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Trizol試劑、M-MLV反轉錄試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；脂質體轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix購自大連寶生物工程有限公司；miR-126 mimic及陰性對照miRNA(miR-126 NC)購自上海吉瑪制藥有限公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；PCNA抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體及二抗均購自美國Cell Signal Technology公司；ECL化學發光檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2細胞分組處理將K562細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(不含抗生素)中，置37 ℃、飽和濕度、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。每隔1～2 d根據細胞生長狀態換液傳代1次。選取對數生長期的K562細胞接種于96孔板中，接種密度為1×105個/mL，置37 ℃培養箱中繼續培養。待細胞生長匯合達50%時，采用Lipofectamine2000將miR-126 mimic或miR-126 NC轉染入細胞中，以不做任何處理的K562細胞為空白對照。轉染后細胞置37 ℃培養箱中繼續培養。

1.33組細胞中miR-126表達水平的檢測分別收集轉染48 h的各組K562細胞，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，利用M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA，并以cDNA為模板使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行PCR。所用引物及測序均由上海生工生物工程有限公司完成。反應體系：cDNA 2 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環。以U6為內參。采用2-ΔΔCt法計算miR-126相對表達水平。實驗重復3次。

1.43組細胞活力的檢測分別在轉染24、48、72、96 h時采用MTT法檢測細胞活力，每組每個時間點3個復孔。于各個時間點每孔分別加入5 g/L的MTT溶液20 μL，置37 ℃培養箱孵育4 h，除去上清液，再向每孔細胞中添加150 μL二甲基亞砜，振蕩至結晶物完全溶解，使用酶標儀檢測每孔在560 nm波長處的光密度(OD)值, 以3孔OD均值表示細胞活力。實驗重復3次。

1.53組細胞凋亡率檢測轉染48 h后分別收集3組細胞，離心棄上清，加入預冷的PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心3 min,去上清，重復2次。采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡率，具體操作參照試劑盒說明書。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.63組細胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達的檢測轉染48 h后，分別收集3組細胞，以PBS洗滌3次，4 ℃ 12 000 ×g離心15 min，加入蛋白裂解液提取總蛋白， BCA法檢測蛋白濃度。將加樣緩沖液與蛋白混合，沸水浴加熱使蛋白變性。每個泳道加入60 μL蛋白樣品，行SDS-PAGE，以濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。將膜用含50 g/L脫脂奶粉的PBST封閉1 h。分別加入1∶500稀釋的PCNA一抗、1∶800稀釋的Bcl-2一抗、1∶800稀釋的Bax一抗4 ℃過夜雜交，以β-actin(1∶800稀釋)為內參。PBST洗膜3次，加入1∶3 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，以ECL發光顯色，成像系統成像拍照，采用Image J軟件分析目的蛋白表達水平。以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白表達水平。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0分析數據。3組細胞中miR-126表達水平，細胞活力，凋亡率，PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.13組K562細胞中miR-126表達水平的比較空白對照組、miR-126 NC組、miR-126 mimic組miR-126表達水平分別為(1.00±0.10)、(0.98±0.11)和(3.19±0.02)，3組miR-126表達水平差異有統計學意義(F=645.373，P<0.001);miR-126 mimic組miR-126表達水平高于miR-126 NC組和空白對照組(P<0.05)。

2.23組K562細胞活力和凋亡率的比較細胞活力和凋亡率檢測結果見表1。miR-126 mimic組K562細胞活力在24、48、72、96 h均低于miR-126 NC組和空白對照組(P<0.05)，凋亡率高于miR-126 NC組和空白對照組(P<0.05)。

表1 3組K562細胞活力和凋亡率的比較

*：與空白對照組和miR-126 NC組比較，P<0.05

2.33組K562細胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白表達的比較結果見圖1和表2。與miR-126 NC組和空白對照組相比，miR-126 mimic組K562細胞中PCNA和Bcl-2蛋白表達水平下調，Bax蛋白表達水平上調(P<0.05)。

1、2、3：分別為空白對照組、miR-126 NC組、miR-126 mimic組

圖1 Western blot法檢測3組K562細胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白的表達

*：與空白對照組和miR-126 NC組比較，P<0.05

3 討論

CML的分子靶向治療已取得較大成效，積極探索新的治療靶點有助于改進CML的治療。miR-126在多種腫瘤中低表達，并且具有抑癌作用[11-12]。Chen等[13]使用miRNA微陣列方法發現，miR-126、miR-21、miR-151-3p等多種miRNA在K562細胞的微囊泡組中的表達低于健康對照組。氫醌處理通過調節miR-126的表達抑制K562細胞紅系分化[14]。提示miR-126可能與CML密切相關。

本研究中，我們用miR-126 mimic轉染K562細胞后，細胞中miR-126的表達水平升高，細胞活力受到抑制，凋亡率升高，細胞中PCNA和Bcl-2蛋白表達水平下調，而Bax蛋白表達水平上調。PCNA與細胞DNA合成密切相關，參與細胞增殖的啟動，因其只存在于處于增殖狀態的細胞中，因此其可用作反映細胞增殖狀態的指標，尤其在腫瘤細胞方面[15]。Bax是Bcl-2基因家族中促凋亡基因，Bax過度表達能夠拮抗Bcl-2的抑凋亡作用，導致細胞趨于死亡[16]。本研究結果表明miR-126可以促進K562細胞凋亡，抑制細胞增殖，提示miR-126可能是白血病治療的新靶點。Gong等[17]研究發現miR-126過表達能夠通過下調ERK信號通路抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成；抑制miR-126表達則可以減少細胞凋亡，增強細胞增殖和腫瘤血管生成。Wu等[18]的研究也表明，miR-126-3p可抑制卡波西肉瘤SLK細胞增殖，阻止細胞周期進程，誘導細胞凋亡，抑制細胞的侵襲，是一種腫瘤抑制因子。本研究的結果與上述文獻中報道的結果一致。

總之，本研究結果表明，上調miR-126的表達可抑制K562細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡，這一效應可能通過上調促凋亡基因Bax的表達實現。miR-126有望成為白血病治療的新靶標。