重組人MG53蛋白激活Akt/GSK-3β通路降低LPS誘導的hUC-MSCs氧化損傷

王亞蘋，張振坤，李 喆，劉騰飛，黃團結，周馨魁， 麻建杰，關方霞，馬珊珊

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州450001 2)美國俄亥俄州立大學戴維斯心肺研究所 哥倫布市 43210

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一種常見的種子細胞，為創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)等難治性疾病的治療帶來希望。但是，TBI后由于組織缺血和炎癥反應會導致細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升，繼而引起組織病變和細胞死亡，抑制外源干細胞的遷移和存活，降低了干細胞的治療效果。MG53蛋白(mitsugumin53 protein)是心肌、骨骼肌特異性蛋白，主要存在于細胞漿和細胞膜內側。在細胞膜結構損傷后，MG53 蛋白可在胞外鈣的作用下由胞漿轉移到胞膜破裂位點，修復受損細胞[1]。外源性給予重組人MG53蛋白，還可修復非肌細胞的膜損傷，對多種細胞和組織損傷具有保護作用[2-4]。研究[5]證明，MG53蛋白能夠和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的p85亞基結合，使其下游的Akt和GSK-3β的磷酸化增加，激活RISK信號通路，從而減輕心肌梗死的嚴重程度。我們的前期研究[6]發現重組人MG53蛋白對H2O2誘導的hUC-MSCs氧化損傷具有保護作用。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠引起多種細胞氧化損傷。本研究利用LPS誘導hUC-MSCs氧化損傷細胞模型，評價重組人MG53對hUC-MSCs氧化損傷的保護作用，探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料hUC-MSCs由課題組前期培養凍存。重組人MG53蛋白(相對分子質量53 000，干粉)由美國俄亥俄州立大學麻建杰教授贈送，LPS購于美國Sigma公司，標準胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12(HAM)1∶1培養基和磷酸鹽緩沖液(PBS)購于以色列BI公司，CCK-8試劑盒購于蘇州宇恒生物科技有限公司，AO-EB試劑盒和JC-1 線粒體膜電位熒光探針購于北京索萊寶公司，ROS檢測試劑盒購于碧云天公司，丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和過氧化氫酶(catalase,CAT)酶標法測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所，β-actin兔多克隆抗體購于武漢三鷹生物有限公司，磷酸化(p-)Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β兔多克隆抗體購于萬類生物有限公司。

1.2hUC-MSCs氧化損傷模型的建立第3代hUC-MSCs 培養至對數生長期后，用胰蛋白酶消化，接種于96孔板，每孔加入100 μL(密度為2.5×103個/mL)細胞懸液，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養。16～18 h后，待細胞融合度達60%，棄去原培養液，PBS清洗2次，加入完全培養基配制的不同質量濃度的LPS(0.5、1.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L)，每個濃度組設3個復孔，繼續在37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養；分別于24、48和72 h后，棄培養液，每孔加入100 μL含體積分數10% CCK-8溶液的無血清培養基，37 ℃繼續孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(A)。以不加LPS處理的細胞為對照。空白孔只加含體積分數10%CCK-8的培養基。存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A陰性對照孔-A空白孔)]×100%。實驗重復3次。根據實驗結果，后續實驗條件設定為200 mg/L LPS處理hUC-MSCs 48 h。

1.3CCK-8法測定細胞活力取對數生長期的hUC-MSCs接種于96孔板。實驗設4組，分別為CON組(不處理)、LPS組(加入200 mg/L LPS)、MG53組(加入30 mg/L重組人MG53蛋白)和LPS+MG53組(同時加入重組人MG53蛋白和LPS)，每組設3個復孔。處理48 h后CCK-8法測定450 nm波長處的A，計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.4細胞凋亡檢測取對數生長期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，棄去原培養基，PBS洗去殘余培養基和未貼壁細胞，加入1 mL PBS。將AO溶液和EB溶液按1∶1混合成工作液(現用現配)。每孔添加20 μL工作液，輕輕搖勻，室溫放置5 min后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。細胞凋亡率為紅綠熒光的比值。實驗重復3次。

1.5線粒體膜電位檢測取對數生長期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，棄去培養基，PBS清洗2次，將細胞與5 μmol/L JC-1在37 ℃下孵育20 min，棄上清，然后用JC-1染色緩沖液洗滌2次，洗去未反應的探針，每孔加入2 mL細胞培養基，30 min內于熒光顯微鏡下觀察和拍照。熒光強度使用Image J軟件分析。用綠紅熒光的比值來衡量線粒體去極化的比例，代表線粒體膜電位。實驗重復3次。

1.6細胞內ROS水平檢測取對數生長期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細胞，用以無血清培養液按1∶1 000稀釋的DCFH-DA懸浮細胞，置于細胞培養箱內孵育20 min。期間每隔3 min上下顛倒混勻一次，使探針和細胞充分接觸。裝載完成后用無血清培養液洗滌細胞3次，充分去除多余的DCFH-DA。30 min后，設置488 nm激發波長，525 nm發射波長，使用流式細胞儀檢測熒光強度，代表ROS水平。實驗重復3次。

1.7細胞內MDA含量、SOD活性和CAT活性測定取對數生長期的hUC-MSCs接種于96孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細胞并計數，調整細胞密度為1×106個/mL，超聲波細胞破碎儀破碎細胞，用微量分光光度計測定蛋白濃度，按照MDA、SOD和CAT測定試劑盒的說明書操作。實驗重復3次。

1.8Western blot法檢測Akt/GSK-3β信號通路蛋白的表達取對數生長期的hUC-MSCs 接種于6孔板，按1.3分組處理48 h后，收集細胞提取蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，進行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉移到PVDF膜上，然后在室溫下用80 g/L(TBST)脫脂乳封閉2 h，加一抗 (β-actin兔多克隆抗體按1∶2 000稀釋，p-Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β兔多克隆抗體按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加二抗(山羊抗兔HRP按1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學發光法顯色，暗室曝光，所得條帶用Image J軟件進行灰度分析。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。實驗重復3次。

1.9統計學處理應用SPSS 19.0處理數據。采用3×7析因設計的方差分析比較不同質量濃度LPS作用不同時間后hUC-MSCs存活率的差異；4組細胞存活率、凋亡率、線粒體膜電位、ROS水平、MDA含量、SOD活性和CAT活性以及相關蛋白表達的比較采用2×2析因設計的方差分析；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1hUC-MSCs氧化損傷模型的建立結果見表1。LPS對hUC-MSCs的損傷和抑制作用具有濃度和時間依賴性。200 mg/L LPS處理48 h后，hUC-MSCs存活率接近50%，故選用此實驗條件用于后續實驗。

表1 不同質量濃度LPS對hUC-MSCs存活率的影響(n=3) %

F時間=279.770,F濃度=360.018,F交互=22.900,P均<0.001

2.2重組人MG53蛋白對LPS誘導的 hUC-MSCs細胞活力和凋亡的影響結果見表2。與LPS組相比，LPS+MG53組細胞存活率升高，凋亡率下降。

2.3重組人MG53蛋白對LPS誘導的 hUC-MSCs線粒體膜電位變化的影響由圖1和表3可知，與CON組相比，LPS組線粒體膜電位升高，而LPS+MG53組較LPS組降低。

2.4重組人MG53蛋白對LPS誘導的hUC-MSCs內ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活性的影響結果見表3，由表3可知，與CON組相比，LPS組hUC-MSCs內ROS和MDA含量增加，SOD和CAT活性降低。然而，重組人MG53蛋白處理較好地逆轉了LPS誘導的這些變化。

2.5重組人MG53蛋白對LPS誘導的hUC-MSCs Akt/GSK-3β信號通路的影響由圖2和表4可知，LPS抑制p-Akt和p-GSK-3β的表達，而LPS+MG53組 p-Akt 和p-GSK-3β表達增加，但是Akt和GSK-3β的表達沒有明顯變化。

表2 4組hUC-MSCs存活率、凋亡率的比較 %

組別線粒體膜電位ROS水平MDA含量/(nmol/mg)SOD活性/(U/mg)CAT活性/( U/mg)CON組7.60±0.2573 075.77±2 842.030.52±0.16610.39±18.67637.34±4.18LPS組42.95±2.57125 393.30±5 410.000.95±0.01284.09±9.86377.18±11.49MG53組7.68±0.5561 488.07±3 341.130.54±0.09644.60±27.55727.50±4.99LPS+MG53組19.75±3.6484 088.23±3 694.470.65±0.01415.68±39.45570.25±20.06FLPS(P)403.836(<0.001)301.615(<0.001)31.172(<0.001)351.079(<0.001)1 001.982(<0.001) FMG53(P)95.998(<0.001)150.341(<0.001)8.841(0.018)31.308(<0.001)461.338(<0.001)F交互(P)97.343(<0.001)47.457(<0.001)10.722(0.011)10.798(0.011)60.912(<0.001)

1～4：分別為CON組、LPS組、MG53組、LPS+MG53組

表4 4組hUC-MSCs Akt/GSK-3β信號通路蛋白表達的比較(n=3)

3 討論

重組人MG53蛋白在組織損傷和細胞膜損傷修復中發揮關鍵性的作用，應用于神經退行性疾病、缺血再灌注損傷、心肌損傷和骨骼肌損傷中均顯示出損傷修復的作用[7-8]。本研究建立了LPS誘導hUC-MSCs氧化損傷的細胞模型，與LPS誘導骨髓干細胞和神經干細胞損傷表現[9-11]一致。本研究發現，重組人MG53蛋白顯著改善了受損的hUC-MSCs的存活，并抑制了凋亡。此外，氧化應激誘導的細胞凋亡與線粒體途徑功能障礙有關[12]。我們發現LPS誘導hUC-MSCs損傷后，細胞內線粒體膜電位降低，而重組人MG53蛋白則可改善這種情況。ROS為氧化應激反應的關鍵因素，本課題組前期實驗[13]證明重組人MG53蛋白對LPS處理后的HT22細胞發揮了抗氧化作用，降低了細胞內ROS水平。本實驗結果顯示重組人MG53蛋白同樣可逆轉LPS刺激hUC-MSCs產生的ROS水平升高。在正常情況下，氧自由基的產生和消除由SOD、CAT和MDA等抗氧化物來維持平衡[14]。本實驗結果顯示重組人MG53蛋白升高了受損細胞中SOD和CAT活性，降低了MDA含量，減輕了LPS誘導的細胞損傷。

PI3K/Akt信號通路是非常重要的凋亡信號通路。報道[5]顯示MG53通過與PI3K的p85亞基相結合來調控PI3K/Akt信號通路，進而對缺血再灌注的損傷心肌發揮保護作用。本實驗結果顯示，LPS誘導損傷的hUC-MSCs中p-Akt水平下降，其下游的信號分子p-GSK-3β水平也降低；重組人MG53蛋白干預治療后，GSK-3β與Akt磷酸化水平在一定程度上得到恢復。

綜上所述，重組人MG53蛋白可能通過激活Akt/GSK-3β信號通路，保護hUC-MSCs免受LPS刺激導致的氧化損傷。重組人MG53蛋白處理可能是一種促進植入臍帶干細胞進行組織修復的有效方法。