重癥肌無力患者胸腺組織中差異表達信號通路分子的篩查

宋 歌, 劉萍萍，李 靜，李倩如，高 峰，張清勇，崔新征，杜 英

1)鄭州大學基礎醫學院免疫學系 鄭州 450001 2)河南省紅十字血液中心 鄭州 450008 3)鄭州大學醫藥科學研究院 鄭州 450052 4)河南省人民醫院重癥肌無力綜合診療中心 鄭州 450003

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是由針對乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)的高親和力IgG抗體(AChR-Ab)介導的自身免疫性疾病[1]，骨骼肌收縮無力為其主要癥狀。已證實胸腺是MG患者產生AChR-Ab的主要部位，MG患者胸腺不僅存在T細胞亞群比例異常,還存在異位生發中心，且能從其中分離出產生自身抗體的B細胞，切除胸腺能使病情得到緩解[2-3]。這些證據都提示胸腺與MG的發生、發展密切相關，但其機制迄今仍不清楚。研究[4]顯示T細胞與胸腺發育分化中一系列的信號轉導過程密切相關[5-6]，而且多種信號通路分子與T細胞亞群形成相關[7]。目前在疾病狀態下T細胞在胸腺分化異常中的機制尚不清楚。為進一步探討MG的發病機制、揭示MG胸腺組織中影響免疫細胞分化的關鍵分子，本研究應用人信號轉導通路發現者基因芯片篩查MG胸腺差異表達分子，并分析信號通路在MG患者T細胞異常分化中的作用，為進一步研究指明方向。

1 對象與方法

1.1研究對象臨床確診的MG患者3例(來自河南省人民醫院重癥肌無力綜合診療中心)，自身抗體AChR-Ab水平均高于正常，年齡12～17歲，男1例，女2例，患者均接受胸腺切除術，胸腺組織病理學分型為胸腺增生型對照組3例，男1例，女2例，年齡6～20歲，均為非自身免疫性心臟病患者(來自鄭州大學第二附屬醫院胸外科)，在接受心臟手術時因暴露手術視野切除部分胸腺組織。研究取材經鄭州大學醫學倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2主要試劑Trizol試劑和cDNA合成反轉錄酶為Invitrogen公司產品，RNA純化試劑盒為Qiagen公司產品，RNase Inhibitor為Epicentre公司產品，2×SuperArray PCR master mix (Cat. No. PA-112)和人信號轉導通路發現者基因芯片為SABiosciences公司產品。Tris-HCl、EDTA、瓊脂糖等購自華美生物工程公司，氯仿、異丙醇、乙醇、乙酸鈉、甲醛等購自上海化學試劑有限公司。

1.3胸腺組織RNA抽提、純化和cDNA合成每例均取50 mg胸腺組織，加入1 mL Trizol試劑研磨制成勻漿。常規提取RNA，經乙醇清洗、干燥，用不含RNA酶的水溶解。按照產品說明書將RNA溶液過柱(RNeasy MinElute Spin Column)、洗脫，獲得純化RNA，并檢測RNA質量和純度。取1.5 μg RNA，加入500 mg/L oligo(dT)1 μL，10 nmol/L dNTPs Mix 1 μL，加滅菌水至13 μL，混勻，置65 ℃ 5 min，冰上1 min，離心后依次加入5×First-Strand Buffer 4 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、SuperScript Ⅲ RT 1 μL，混勻，50 ℃溫育60 min，70 ℃ 15 min使酶失活。每20 μL cDNA加91 μL滅菌水混勻，-20 ℃保存。

1.4胸腺組織信號通路差異表達基因的檢測分別取2組已稀釋的cDNA 102 μL，加入2× SuperArray PCR master mix 550 μL，ddH2O 448 μL。取10 μL混合液加至人信號轉導通路發現者基因芯片(表1)，加蓋密封，置于實時定量PCR儀進行PCR反應。95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，擴增40個循環。收集熒光，進行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。

表1 人信號轉導通路發現者基因芯片所含信號通路及基因

1.5qRT-PCR驗證實驗為進一步證實芯片的檢測結果，針對FOSL1、SOCS3、CCL5基因進行qRT-PCR。取留存的胸腺組織提取RNA，經qRT-PCR分析，結果與芯片結果進行比對。所用引物序列如下，SOCS3：5’-CCCCAGAAGAGCCTATTACAT-3’,5’-TCCAGGAACTCCCGAGTG-3’;FOSL1: 5’-CTGCTGCTACTCTTGCGATG-3’,5’-TGACCACACACCCTCCCTAACT-3’; CCL5:5’-CCATATTCCTCGGACACCAC-3’,5’-GGTGACAAAGACGACTGCTG-3’。按照SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)產品說明書進行操作。同上計算目的基因表達水平。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較2組基因表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1RNA質量鑒定對照組和MG組胸腺組織總RNA經變性電泳，所有樣本均顯示出28S、18S和5S核糖體RNA條帶，并可見彌散的mRNA，說明所提RNA樣本符合后續實驗要求。

2.2MG胸腺組織中信號通路差異基因的篩選芯片檢測結果顯示，與對照組比較，MG組18個基因表達升高，4個表達降低，見表2。

表2 MG組與對照組胸腺組織差異表達基因的表達水平

2.3驗證結果見表3。MG組胸腺組織SOCS3、FOSL1的表達高于對照組，而兩組CCL5的表達差異無統計學意義，與芯片結果基本一致。

表3 SOCS3、FOSL1和CCL5mRNA表達的qRT-PCR驗證結果

3 討論

信號轉導通路是決定T細胞發育、分化成熟和功能的關鍵因素。本研究對MG患者胸腺組織信號轉導通路進行基因芯片檢測，發現20多種差異表達的信號分子，涉及Notch、WNT、JAK/STAT、NF-κB、TGF-β等多條信號通路。文獻[8]顯示，細胞因子信號轉導抑制分子SOCS1和SOCS3是早期胸腺細胞發育的關鍵調節因子，其缺乏會干擾胸腺發育。缺乏干擾素調節因子1(IRF1)的小鼠表現為胸腺和外周淋巴器官中成熟CD8+T細胞數量減少，說明IRF1在CD8+T細胞分化中起關鍵作用[9]。HES1是轉錄因子發狀分裂相關增強子中的一個成員，是Notch信號通路中影響T細胞分化的關鍵分子[10]。WNT通路中FOS樣抗原1(FOS-like antigen 1,FOSL1)的作用是與Jun蛋白形成二聚體，組成激活蛋白1，通過激活蛋白1與DNA結合，參與細胞的增殖和分化，抑制細胞凋亡[11]。上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1，EMP1)、生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45B(growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45β，GADD45B)是TGF-β信號通路分子。有報道[12]顯示EMP1與細胞增殖、轉化、惡化相關，也有報道[13]EMP1抑制細胞增殖和促進凋亡，這些結果的不一致提示EMP1在不同細胞中可能以不同的方式發揮作用。GADD45B是抑制細胞凋亡的基因， 主要通過調控p53和JNK發揮作用[14]；GADD45B還是TGF-β的下游基因，即TGF-β通過調控GADD45B而抑制細胞生長及促進凋亡[15]。阻斷GADD45B表達，TGF-β對M1細胞的促凋亡作用降低[16]。另外，在T細胞中，GADD45B基因可由TCR或炎癥信號快速誘導產生，缺乏GADD45B的CD4+T細胞對T細胞受體刺激或炎癥細胞因子的反應性降低，產生細胞因子的能力也降低[17]。Castellani等[18]發現，ADM及其共受體蛋白RAMP2存在于新生兒胸腺上皮細胞(thymic epithelial cells, TECs)內，并通過動物實驗證實ADM在大鼠TECs中通過與細胞核內受體相互作用，調節NF-κB基因轉錄，減少IL-6分泌；因此認為ADM在自身免疫病中起保護作用，且TECs的ADM系統可能是免疫調節藥物的一個新的潛在靶點。絲氨酸蛋白酶抑制劑家族E成員1(serine proteinase inhibitor family E member 1，SERPINE1)是一種損傷早期的反應因子，在細胞成熟和增殖中具有調節作用[19]。

綜上所述，芯片篩查結果顯示SOCS3、IRF1、HES1、FOSL1、EMP1、GADD45B、ADM、SERPINE1等在MG患者胸腺組織中的表達升高，提示它們與胸腺異常及MG疾病的發生有關。上述分子涉及不同信號通路，通過不同方式調節細胞增殖、分化和凋亡。本研究結果有助于開拓MG研究的新方向，也將為深入研究胸腺細胞異常發育、MG胸腺異常及疾病發生機制提供新思路。