黑枸杞花青素提取工藝優(yōu)化和含量測定

鞏芳芳，廖碧芳，董佳佳，于 斐，劉利娥，李文杰

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 鄭州 450001

花青素是普遍存在于深色植物中的一類水溶性天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、降低血栓形成風(fēng)險等多種功能[1-2]，近年來引起諸多學(xué)者的關(guān)注。黑枸杞是傳統(tǒng)的中藥，成熟漿果呈現(xiàn)黑色，花青素含量極其豐富，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的花青素含量最多的天然野生植物，是提取天然花青素的最佳原材料。但天然花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)缺少一個電子，極易受到活性氧基團(tuán)和自由電子攻擊而降解，穩(wěn)定性較差，不同pH、光照、氧、溶劑、溫度變化以及蛋白質(zhì)和一些金屬離子都會引起花青素結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，給花青素的提取帶來了很大的挑戰(zhàn)。

目前花青素的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取和酶輔助法提取等。用正交實驗或響應(yīng)面可對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用單一pH法、pH示差法[3-6]、差減法和高效液相色譜法等可對花青素含量和組分進(jìn)行測定。正交實驗所需的實驗次數(shù)少，數(shù)據(jù)點分布均勻，但是無法找到因素和響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達(dá)式。相較于正交實驗，響應(yīng)面分析法得到的回歸方程精準(zhǔn)度高，可以明確找到各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。測定花青素的方法中，單一pH法和差減法操作簡單，但是準(zhǔn)確率較低；高效液相色譜法準(zhǔn)確率較高，但標(biāo)準(zhǔn)品昂貴且不穩(wěn)定。本實驗以體積分?jǐn)?shù)70%酸性乙醇為提取液，采用超聲波輔助法提取黑枸杞中的花青素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，應(yīng)用pH示差法測定花青素含量，并比較不同產(chǎn)地黑枸杞中花青素含量的差異，以期為天然產(chǎn)物的開發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑UV-1601分光光度計、UV-1000紫外可見分光光度計(北京華科儀科技股份有限公司)，高速粉碎機(jī)(廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(深圳大都工業(yè)有限公司)。氯化鉀(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，醋酸鈉(北京康普匯維科技有限公司)，醋酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、鹽酸(洛陽市昊華化學(xué)試劑有限公司)，實驗所用試劑均為分析純。黑枸杞產(chǎn)地分別為寧夏中衛(wèi)和石嘴山，新疆阿克蘇、庫爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海德令哈、諾木洪和格爾木，內(nèi)蒙古烏拉特前旗、額濟(jì)納旗和烏蘭察布，甘肅酒泉、敦煌、武威市和白銀，西藏拉薩、山南和日喀則。

1.2樣品前處理去除黑枸杞根部，置恒溫干燥箱中，60 ℃干燥至恒重后密閉冷卻，用高速粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，收集后放置在具塞廣口瓶中密封避光保存。

1.3花青素的提取

1.3.1 提取工藝 稱取吐魯番黑枸杞粉末1 g，采用體積分?jǐn)?shù)為70%的酸化乙醇提取。初步設(shè)定料(g)液(mL)比為1∶20，超聲波提取功率為50%，提取溫度為40 ℃，提取時間為20 min，保持其中3個因素不變，改變另一個因素。隨后取花青素提取液3 mL，5 000 r/min離心3 min。轉(zhuǎn)移上清至另一個離心管中，錫箔紙包裝，密封，放置在冰箱中冷藏。采用文獻(xiàn)[7]的方法分析料液比、超聲波提取功率、提取溫度和提取時間對黑枸杞中花青素提取率的影響，實驗重復(fù)3次。

1.3.2 優(yōu)化方法 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇單因素最適濃度范圍，用Box-Behnken設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗提取黑枸杞花青素。

表1 響應(yīng)面因素水平

1.4花青素含量的測定

1.4.1 波長確定 將花青素提取液用UV-1601分光光度計在400～700 nm范圍內(nèi)掃描，測定花青素提取液分別在pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液中的吸光度，吸光度出現(xiàn)最大差值時所處的波長(525 nm)為測定的最佳波長。對于渾濁樣品，則需要同時測定樣品在700 nm處的吸光度[6]。

1.4.2 花青素含量的測定 取樣品提取液80 μL，分別加入pH 1.0的緩沖溶液和pH 4.5的緩沖溶液稀釋至8 mL，搖勻后置40 ℃的恒溫水浴鍋中平衡，pH 1.0的緩沖溶液平衡時間為30 min，pH 4.5的緩沖溶液平衡時間為20 min。隨后測定兩種不同pH提取液在525 nm和700 nm處的吸光值，按公式[4]計算花青素的提取率和含量，每個樣品測量3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1花青素提取工藝的單因素結(jié)果見圖1。花青素提取率隨著提取溫度、提取時間、提取功率、料液比增大均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。故在提取溫度30～50 ℃，提取時間20～30 min，提取功率為60%，料液比1∶20～1∶40范圍進(jìn)行響應(yīng)面實驗。

2.2花青素提取工藝優(yōu)化的實驗結(jié)果根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗的因素和水平，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

利用Design-Expert 軟件進(jìn)行回歸擬合和方差分析，花青素提取率的回歸方程為：Y=1.71-0.041A+0.14B-0.029C+0.05AB-0.077AC+0.042BC-0.065A2-0.1B2-0.16C2。回歸模型的R2=0.951 6，RAdj=0.889 5，說明該模型與實際擬合程度較好。交互作用分析圖見圖2。從模型分析結(jié)果可知，一次項因素B、交互項AC和二次項A2、B2、C2對黑枸杞花青素提取率的影響顯著(F=55.200、8.031、6.081、14.960、35.202，P=0.001、0.025、0.043、0.006、0.001)。以上3個因素對花青素提取率的作用不是直接的線性關(guān)系，其對花青素提取率影響為提取時間>提取溫度>料液比。

通過回歸方程確定的最佳提取工藝為：提取溫度39.41 ℃，提取時間28.38 min，料液比1.00∶30.13。此條件下花青素提取率的理論值最大為1.755%。為方便實際操作，最佳提取工藝設(shè)定為提取溫度39 ℃，提取時間28 min，料液比1∶30。取6份等量的吐魯番黑枸杞粉末按最佳提取工藝進(jìn)行實驗，平均提取率為1.701%，與理論值的相對誤差為3.17%，偏差較小。

A:料液比和提取溫度；B：提取時間和料液比；C：提取溫度和提取時間

2.3不同產(chǎn)地黑枸杞中花青素含量的測定西藏的山南和日喀則的黑枸杞中花青素的含量最高，分別為0.030 1和0.025 3 g/g。內(nèi)蒙古的烏蘭察布、額濟(jì)納旗，甘肅的武威市和寧夏的石嘴山花青素含量也較高，分別為0.027 9、0.021 2、0.020 4、0.022 3 g/g。新疆的阿克蘇、庫爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海的德令哈、諾木洪和格爾木，內(nèi)蒙古的烏拉特前旗，西藏的拉薩和寧夏的中衛(wèi)的黑枸杞中花青素含量較為平均，差異較小，分別為0.015 6、0.017 8、0.015 4、0.015 1、0.017 1、0.016 9、0.015 6、0.016 7、0.018 2、0.016 7、0.019 3、0.017 9 g/g。甘肅的酒泉、敦煌和白銀的花青素含量較低，分別為0.012 5、0.014 8、0.015 4 g/g。這可能是不同產(chǎn)地的氣候條件和土壤因素有差異，導(dǎo)致黑枸杞得到的光照、降水量和營養(yǎng)成分不同，對花青素的合成和積累造成影響。

3 討論

本實驗采用超聲輔助法提取黑枸杞中天然花青素，并對提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。得到提取花青素的最佳工藝為：提取溫度39 ℃，提取時間28 min，料液比1∶30，超聲功率60%。經(jīng)驗證后，理論值與實際值的偏差較小，可用于實際樣品中天然花青素的提取。采用此工藝，對不同產(chǎn)地的黑枸杞中花青素進(jìn)行提取和測定，結(jié)果表明黑枸杞中花青素的含量豐富，其中產(chǎn)自西藏的黑枸杞花青素含量最高，產(chǎn)自甘肅的黑枸杞花青素含量較低。導(dǎo)致差異的原因可能是西藏地區(qū)海拔較高，日照時間較長，晝夜溫差較大，土壤有機(jī)質(zhì)沉積明顯，降水量分布都有利于黑枸杞的生長發(fā)育，使得黑枸杞中含有豐富的花青素；而甘肅的光照雖然充分，但其氣候干燥少雨，氣溫較低。相較而言，西藏的氣候和土壤條件更能滿足黑枸杞對水量和光照的要求，說明產(chǎn)地的氣候條件和土壤條件會對黑枸杞中花青素含量產(chǎn)生影響。本論文可為黑枸杞中天然花青素提取和開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。