反復肢體缺血預處理對大鼠腦缺血再灌注組織NF-κB信號通路及炎癥因子含量的影響

王小琴,鄒玉安,薛 茜,常 青,孫 炎

(河北北方學院附屬第一醫院神經內科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:baiyitiansho@163.com)

缺血性腦血管病具有發病率高、復發率高、致殘率高、致死率高等特點,嚴重危害了人類的健康和生命,因此它的防治逐漸引起了全球關注。早在1990年,Kitagawa等[1]首次發現在沙鼠全腦缺血之前給予一個短暫輕微的腦缺血可以減輕神經損傷,隨后該發現引起了全球廣泛的關注,這種預先給予的輕微缺血被稱為缺血預處理。隨后大家發現這種缺血預處理的保護現象存在于多種器官如心臟、肝臟、腎臟等[2-4]。但由于腦缺血預處理操作復雜,臨床應用價值不大,而后續大量實驗研究發現間斷的給予遠端肢體數次輕微的、亞致死性的缺血即肢體缺血預處理(limb ischemic preconditioning,LIP),同樣可以預先調動內源性保護機制來減輕之后更嚴重缺血缺氧損傷的過程[5-7],但到目前為止LIP具體的內源性保護機制仍不明確。

大量研究認為,腦缺血再灌注損傷的機制包括興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、炎癥反應、Ca2+內流、誘導凋亡等多種途徑實現的,并且各途徑相互作用形成一個非常復雜的級聯反應,最終結果是神經細胞的死亡[8]。近年來研究發現,炎癥反應包括上游轉錄因子的激活和下游炎癥因子的釋放,在缺血再灌注損傷中起關鍵性作用[9]。其中核轉錄因子NF-κB信號通路是調節炎癥反應的經典通路。腦缺血再灌注損傷后可以活化NF-κB,進而促進多種炎癥因子如TNF-α、IL-6的大量表達,加重炎癥反應,而TNF-α、IL-6的產生又可以反過來進一步激活更多NF-κB的表達,進一步損傷腦組織。本研究主要觀察LIP是否通過抑制NF-κB信號通路、降低TNF-α、IL-6炎癥因子的含量來減輕缺血再灌注損傷,探討LIP誘導內源性神經保護的機制,為缺血性和缺氧性腦病的臨床防治提供有效的策略。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

雄性SD大鼠(14-16周齡)PF/UAF級,體質量(260±15)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號:SCXX(京)2014-0004。動物被隨機分為3組,sham組(n=12),I/R組(n=36),LIP+I/R組(n=36),后兩組又分為1,3,7 d亞組,每組12只,其中4只用于腦梗死體積測定,4只用于腦組織細胞形態觀察及NF-κB/p65表達檢測,4只用于TNF-α和IL-6含量測定,本實驗共使用96只大鼠,剔除造模過程中死亡和造模不成功的大鼠,最終保證各時間點12只大鼠。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗大鼠NF-κB/p65抗體、山羊抗兔SP試劑盒(IgG抗體)、DAB顯色盒(美國Santa Cruz公司);氯化-2,3,4-三苯基四氮唑(TTC)染色試劑(美國Amresco公司),TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成科技有限公司)。Safire2全波長多功能酶標儀(瑞士Tecan);栓線(北京西濃科技有限公司);生物組織脫水機(美國Thermo)。

1.3 大腦中動脈阻塞模型及肢體缺血模型制作

sham組:將雙側頸總動脈分離干凈并暴露;I/R模型組:根據Zea-Longa的方法[10]建立右側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型;LIP+I/R組:將SD大鼠腹腔麻醉后仰臥固定于手術臺上,在兩側股三角處剪毛消毒行縱行切口鈍性分離雙側股動脈,用動脈夾將雙側股動脈同時夾閉10 min,隨后移去動脈夾恢復股動脈血流10 min,共進行3次,完畢后30 min,再行右側大腦中動脈(MCAO)模型,方法同上。

1.4 神經功能缺損評分

在術后24 h,大鼠清醒狀態下按照Zea Longa 5級評分法[10]進行評定。評分標準:0分,無明顯神經損害癥狀;1分,無對側前爪完全伸展;2分,行走時對側旋轉;3分,行走時偏斜;4分,不能自主行走。昏迷死亡者剔除實驗。

1.5 TTC染色法測定腦梗死體積

分別在實驗設計相應時間點,10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,迅速斷頭取腦,沿冠狀面切成5片,每片厚約2 mm,迅速浸入2%的TTC磷酸鹽緩沖液中,37 ℃水浴箱避光孵育30 min,均勻染色后,丟棄TTC,將腦片放入4%多聚甲醛中,放入4 ℃冰箱中固定24 h,逐層拍照:按公式[(各片正反面梗死面積之和/2×片厚)/(各片正反面總面積之和/2×片厚)×100%]計算梗死體積占所取腦組織體積的百分比。

1.6 光鏡下觀察腦組織細胞形態

將多聚甲醛固定好腦組織切片進行包埋并制成蠟塊,再切成4 μm厚度的腦組織石蠟切片。石蠟切片按HE染色步驟經脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片,光鏡下觀察腦組織細胞形態。

1.7 免疫組織化學檢測NF-κB/p65的表達

腦組織切片經脫蠟、脫水、PBS反復沖洗,進行抗原修復,3% H2O2封閉,10%山羊血清孵育20 min,后加去山羊血清加入一抗工作液,放于4 ℃冰箱過夜;第二天復溫20 min,移去一抗,PBS液沖洗3次,每張切片滴加二抗(山羊抗兔IgG),室溫孵育20 min,PBS液反復沖洗3次,甩去PBS液,每張切片滴加DAB顯色,脫水透明封片。鏡下觀察并拍照,NF-κB/P65陽性細胞的胞核部分和胞質部分呈現出棕黃色顆粒。記錄NF-κB/P65陽性細胞占整個視野的比例,采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件進行分析。

1.8 ELISA檢測缺血區腦組織TNF-α、IL-6含量

在實驗設計相應時間位點,分別將大鼠麻醉后,迅速冰盤上斷頭取腦,稱重,加入1 ∶9倍量的0-4 ℃生理鹽水,在冰水浴上機械勻漿得10%腦組織勻漿,將腦勻漿在4 ℃條件下以3 500 r/min低溫離心15 min,取上清置于-80 ℃冰箱備用,用于TNF-α、IL-6的測定。具體方法參照試劑盒說明。

1.9 統計學分析

使用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析,結果用均數±標準差表示,數值變量資料分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA),實驗結果以均數±標準差表示。方差齊時組間兩兩比較采用最小顯著差LSD檢驗,方差不齊時采用Tamhane’sT2法檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能損傷評分結果

在實驗設計各時間點,sham組無神經功能損傷癥狀,LIP+I/R組和I/R組大鼠分別出現不同程度神經功能缺失癥狀,LIP+I/R組Longa評分較I/R組明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05,見表1)。

2.2 各組大鼠腦梗死體積測定結果

在實驗設計各時間點,sham組腦組織無梗死病灶,各時間點LIP+I/R組腦梗死體積均較I/R組明顯縮小(P<0.01,見表2)。

表1 大鼠缺血再灌注各時間點的Longa評分

Table 1 The Longa scores in rats at each time point after cerebral ischemia reperfusion

組別第1天 第3天 第7天 sham組0 0 0 I/R組2.72±0.43?2.83±0.46?2.62±0.51?LIP+I/R組1.72±0.41?#1.82±0.56?#1.69±0.43?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

表2 各組大鼠缺血再灌注各時間點的腦梗死體積(n=4,%)

Table 2 Cerebral infarct volume in rats at different time after cerebral ischemia(n=4, %)

組別第1天 第3天 第7天 sham組0 0 0 I/R組25.76±1.32??44.90±3.43??41.21±3.98??LIP+I/R組20.84±1.74?#38.17±1.85?#35.60±1.86?#

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與I/R組比較,#P<0.05

2.3 腦組織病理學變化

光鏡下,sham組海馬區神經元排列整齊,細胞結構完整,胞質豐富,胞核飽滿,核膜、核仁清晰,無明顯腫脹、細胞核固縮、碎裂現象;I/R組腦組織梗死區細胞排列紊亂,細胞體積明顯縮小,大量細胞的胞核固縮、碎裂,組織間蒼白、水腫,幾乎觀察不到正常組織結構;LIP+I/R組可見細胞排列較規則,細胞損傷程度較輕,部分細胞有體積縮小、細胞核固縮、核碎裂等現象,但與I/R組相比,細胞變性死亡數量明顯減少(見圖1)。

A.sham組 B.I/R組再灌24 h C.LIP+I/R組再灌24 h圖1 HE法染色后光鏡下觀察大鼠腦組織病理變化 (HE,×400)Figure 1 Histopathological changes of rat brain under light microscope after HE staining (HE,×400)

2.4 免疫組織化學檢測腦組織NF-κB/P65陽性細胞

sham組可見極少量NF-κB/P65陽性細胞表達;與sham組比較,LIP+I/R組和I/R組NF-κB/P65陽性細胞表達百分比明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01);LIP+I/R組較I/R組NF-κB/P65的表達百分比有所下降,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖2、表3)。

A.sham組 B.I/R組 C.LIP+I/R組圖2 免疫組化法檢測大鼠腦組織NF-κB/p65的表達 (×400)Figure 2 The expression of NF-κB/p65 in brain tissue of rats by immunohistochemistry (×400)

表3 大鼠缺血再灌注各時間點的腦組織NF-κB/P65表達(n=4,%)

Table 3 Expressions of NF-κB/P65 in brain tissue of rats at each time point after ischemia-reperfusion(n=4,%)

組別第1天 第3天 第7天 sham組 4.23±1.01 5.42±1.78 3.99±0.92I/R組59.76±1.32??67.21±13.21??62.76±16.28??LIP+I/R組36.48±9.27??#40.92±10.25??#34.38±8.66??#

與sham組比較,**P<0.01;與I/R組比較,*P<0.05

2.5 腦組織TNF-α、IL-6含量的變化

與sham組比較,LIP+I/R組和I/R組TNF-α、IL-6的含量第1天開始升高(P<0.05),第3天達高峰,第7天仍高于正常水平,差異有統計學意義。與I/R組比較,LIP+I/R組各時間點TNF-α、IL-6的含量均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見表4,5)。

表4 大鼠缺血再灌注各時間點腦組織中TNF-α的含量(ng/L,n=6)

Table 4 Comparison of content of brain TNF-α in rats among all groups(ng/L,n=6)

組別第1天 第3天 第7天 sham組 84.45±15.54 83.76±15.90 85.34±16.65I/R組112.53±22.32?157.76±28.87?118.12±19.76?LIP+I/R組104.87±22.38?#138.04±25.65?#103.40±14.35?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

表5 大鼠缺血再灌注各時間點腦組織中IL-6的含量(ng/L,n=6)

Table 5 Comparison of content of brain IL-6 in rats among all groups(ng/L,n=6)

組別第1天第3天第7天sham組11.09±1.6310.16±2.0811.16±2.08I/R組25.61±3.50?16.98±2.98?15.32±2.61?LIP+I/R組19.05±2.79?#15.74±2.83?#13.84±2.14?#

與sham組比較,*P<0.05;與I/R組比較,#P<0.05

3 討論

LIP作為一種新的腦保護方法已經被大量實驗證實,Ren等[11]發現單次肢體缺血預處理可提供短期保護,但在再灌注14 d內,聯合反復遠端預處理可以明顯改善腦缺血再灌注損傷,但遠端肢體與大腦相距離較遠,其保護機制仍然不清楚,目前推測其可能是通過神經內分泌系統實現的,可能機制包括抑制自由基毒性、抑制炎癥反應、調節一氧化氮含量、增加線粒體功能、減輕興奮性氨基酸毒性、促進細胞增殖以及抑制凋亡等。NF-κB是廣泛存在于神經元及神經膠質細胞內的一種轉錄因子,它在炎癥反應中起至關重要的作用,目前已經發現它可以通過與IL-1、IL-6、TNF-α等基因啟動子結合而啟動轉錄功能,產生大量IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子及黏附因子和趨化因子等,導致細胞死亡[12]。同時相關炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α也反過來促進NF-κB表達增強,他們相互促進形成惡性循環,進一步加重損傷。TNF-α作為一個前炎癥因子是啟動炎癥的關鍵因子,一旦機體出現缺血、缺氧、微生物感染等情況便會引發炎癥免疫瀑布,損傷機體,因此,它是腦缺血再灌注損傷過程中一個重要的炎癥因子[13]。IL-6作為一種神經營養因子具有多種生物學功能,機體正常情況下其含量較低,對神經元有營養保護和修復損傷的作用。腦缺血后TNF-α、IL-6作為重要的前炎癥細胞因子在炎性細胞反應出現之前出現,然后通過復雜的網絡來影響其他炎癥因子、炎性細胞功能和合成,從而介導隨后的缺血損傷。因此抑制NF-κB通路,減少TNF-α、IL-6的含量可以明顯減輕炎癥反應。

本研究觀察了各組NF-κB信號通路中的NF-κB/P56蛋白,以及TNF-α、IL-6的含量,結果發現,腦缺血再灌注的腦組織中NF-κB/P56表達明顯增強,TNF-α、IL-6的含量明顯升高,并且NF-κB/P56表達的強弱與腦梗死體積大小呈正相關,提示NF-κB參與了腦缺血再灌注損傷的過程,這與Williams等[14]的結果是一致的。而提前給予數次LIP能夠降低大鼠神經功能缺損,保護神經元。與此同時,我們也觀察到LIP可以降低缺血腦組織中TNF-α、IL-6的含量,表明LIP可能通過抑制NF-κB信號通路的激活來減少TNF-α、IL-6等炎癥因子釋放從而減輕炎癥反應,實現內源性保護作用。