糖尿病大鼠四肢痛閾及周圍神經超微結構的變化

周 芳,劉 康,潘 俠,黃亞醫,王 龍

(武漢大學人民醫院麻醉科,武漢 430060;*通訊作者,E-mail:wanglongwhu@163.com)

糖尿病是一組代謝臨床綜合征,其發病機制復雜。目前糖尿病的實驗動物模型主要分為遺傳性動物模型、轉基因動物模型和誘發性動物模型。前兩者由于價格昂貴、飼養困難,發病程度難以把握及經驗有限等缺點采納較少,而誘發性動物模型研究得比較清楚,是大多數學者常采用的模型。誘發性動物模型最常采取的辦法是使用手術或者化學方法破壞動物的胰腺組織,其中最常使用的化學藥物有STZ和四氧嘧啶。STZ不僅能直接破壞胰島β細胞,還能通過誘導一氧化氮(NO)和自由基的合成,激活自身免疫過程,從而導致β細胞的損壞。而四氧嘧啶主要是通過產生超氧自由基破壞β細胞,導致胰島素合成減少,胰島素缺乏。相比較而言,STZ單次腹腔注射制備糖尿病模型動物死亡率低,成模率高,模型穩定,操作方便,價格低廉,是目前國內外普遍使用的造模方法。然而此方法大鼠出現痛閾改變的時間報道不一,分析原因可能與動物品種、STZ配置方法、STZ用量、痛閾測定方法等相關。本文結合武漢大學人民醫院用藥經驗及其他學者經驗[1-3],采用60 mg/kg體質量STZ單次腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,旨在觀察大鼠四肢痛閾的改變以及背根神經節細胞和腓腸神經的病理改變。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡雄性SD大鼠50只,清潔級,體質量200-220 g,來源于中國湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002],飼養于武漢大學人民醫院實驗動物中心(SPF級)[SYXK(鄂)2015-0027],每籠3-4只大鼠,自由攝食飲水,動物室內有良好的通風和空氣過濾系統,室內溫度在20-22 ℃,濕度50%-67%,光照與黑暗時間各為12 h,每天更換墊料,每周更換籠具3次。每只動物在飼養及實驗過程中均按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷[WDRM(福)第20150702]。

1.2 主要儀器與試劑

美國強生穩豪倍優血糖儀;Von Frey纖維絲(美國Stoelting公司);STZ(美國Sigma公司);枸櫞酸緩沖液粉劑(北京華科盛公司)。

1.3 動物分組

10只大鼠做為正常對照組,模型組40只。所有大鼠均適應性飼養1周,測定基礎血糖、體質量、痛閾。將模型組的40只大鼠用于制備DM模型,DM造模不成功的大鼠予以剔除。

1.4 STZ溶液的配置

2% STZ溶液的配置:①稱取21.01 g的枸櫞酸粉劑,用雙蒸水溶解并將液體定容到1 000 ml,配置0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液;②稱取29.41 g的枸櫞酸鈉粉劑,雙蒸水溶解并定容至1 000 ml,配置0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液;③取0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液22 ml,加入0.1 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液28 ml,混勻,配置pH4.5的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液,4 ℃保存備用;④快速稱取STZ后置入干燥滅菌瓶內,外用錫箔紙避光,將pH4.5的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液及裝STZ的容器置冰浴帶入動物室,在冰上操作配置2%的STZ溶液,現配現用。

1.5 糖尿病模型的制備

糖尿病組采用高糖高脂飲食適應性飼養1周后,于造模前禁食12 h,按60 mg/kg體質量的劑量一次性腹腔注射2%的STZ溶液,腹腔注射72 h后經尾靜脈取血測定空腹血糖,血糖≥16.7 mmol/L即為造模成功[1-3]。

1.6 機械痛閾的測定

采用up-and-down法,在糖尿病造模前、糖尿病造模成功后每周用Von Frey纖維絲(0.40,0.60,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,15.0 g)測定每組大鼠后腳趾對機械刺激50%縮爪閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的改變。具體操作步驟如下:大鼠單獨置于有網眼的支架鐵絲板上,適應環境約30 min;待大鼠安靜,用2.0 g力度的細絲由下向上垂直刺激兩側后趾外側皮膚,直至成S形,每次刺激持續時間為6-8 s。注意避開肉墊,大鼠在刺激時間內或在移開von Frey纖維絲時立即出現快速的縮足反應記為陽性反應,除身體活動引起的縮足反應,兩次刺激間隔時間最少為5 s;若無縮爪反應,則選擇更強力度的4.0 g刺激后腳趾;若有縮爪反應,則選擇較弱力度的1.0 g刺激后腳趾。依次類推,當出現一次與前一次不同的反應(如有縮爪反應變為無縮爪反應,或無縮爪反應變至有縮爪反應)時,繼續依次刺激4次,包括先前的2次刺激,總共6次刺激,即可完成50%縮爪閾值的測定;若對有縮爪反應時所需要的刺激力度高于15.0 g或低于0.40 g的時,50%縮爪閾值則直接記為15.0 g或0.4 g[4-6]。

1.7 背根神經節和腓腸神經透射電鏡形態學觀察

造模成功后2,4,6周,每次隨機選取8只大鼠采用1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg,腹腔注射)麻醉,分離背根神經節和腓腸神經,置于2%的戊二醛液中4 ℃保存。磷酸緩沖液漂洗3次,環氧樹脂包埋,常規超薄制片,醋酸雙鉛鈾和枸櫞酸鉛染色,用透射電鏡觀察。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 成模率及死亡率

40只大鼠,有33只血糖高于16.7 mmol/L達到成模標準,造模成功率為82.5%;所有大鼠均存活,死亡率為0。

2.2 大鼠一般狀態的變化

正常組大鼠飲食及尿量正常,精神飽滿,反應敏捷,體質量隨周齡的增加而逐漸增加;糖尿病組大鼠造模后飲食、尿量明顯增多,隨病程的增加精神逐漸萎靡,反應遲鈍,體型明顯消瘦(見圖1)。

與正常組相比,*P<0.05圖1 正常組與糖尿病組大鼠體質量變化趨勢Figure 1 The variation trend of body weight in control group and diabetic group

2.3 血糖的變化

正常對照組血糖均在正常范圍,隨周齡無明顯變化;糖尿病組血糖在造模后第1周即明顯升高,此后隨時間的延長逐漸增加,且高血糖狀況持續整個實驗過程(見圖2),說明本實驗糖尿病模型造模是成功的。

2.4 機械痛閾的改變

STZ造模成功后1周,糖尿病組大鼠的機械痛閾即低于正常組大鼠,且痛閾隨時間的延長逐漸降低,與正常組大鼠間存在顯著性差異(見圖3),說明隨糖尿病病程的進展,大鼠逐漸出現痛覺敏化。

與正常組相比,*P<0.05圖2 正常組與糖尿病組大鼠血糖變化趨勢Figure 2 Changes of blood glucose in control group and diabetic group

與正常組相比,*P<0.05圖3 正常組與糖尿病組大鼠機械痛閾變化趨勢Figure 3 The variation trend of mechanical withdrawal threshold in control group and diabetic group

2.5 背根神經節超微結構的改變

糖尿病制模成功后第2周末,核膜無明顯皺褶,極少數內質網水腫,高爾基體清晰可見;第4周末可見核膜局部出現皺褶,內質網水腫較明顯,小部分空泡化;第6周末核膜皺縮加重,絕大多數內質網空泡化(見圖4),說明隨糖尿病進程的進展,背根神經節細胞的損傷是逐漸加重的。

造模后2周末 造模后4周末 造模后6周末圖4 造模成功后電鏡下糖尿病組大鼠背根神經節的變化 (×4 000)Figure 4 Changes of dorsal root ganglion cells after successful modeling under electron microscopy (×4 000)

2.6 腓腸神經的超微結構變化

糖尿病制模成功后第2周末,腓腸神經結構基本正常,髓鞘局部出現斷裂;第4周末髓鞘板層局部排列紊亂伴大量空泡形成;第6周末髓鞘正常形態消失,部分髓鞘已經溶解吸收,軸突內可見較多壞死物(見圖5),說明長期的高血糖可導致有髓神經纖維出現脫髓鞘改變,且這一改變也是隨糖尿病病程進展而逐漸加重的。

造模后2周末 造模后4周末 造模后6周末圖5 造模成功后電鏡下糖尿病組大鼠腓腸神經的變化 (×2 500)Figure 5 Changes of sural nerve after successful modeling under electron microscopy (×2 500)

3 討論

神經病理性疼痛是常見的一種疼痛類型,據估計全世界有幾百萬人遭受神經病理性疼痛,約占總人數的7%[7]。糖尿病是引起神經病理性疼痛的主要原因之一,嚴重影響病人的生活質量,甚至造成功能障礙,還增加醫療費用,加重家庭負擔。因此,該疼痛模型的建立對深入研究糖尿病的發病、治療、預防及其并發癥的轉歸有著重要意義。

糖尿病大鼠出現神經病變的機制目前尚不清楚,但普遍認為與高血糖是密切相關的[8]。已知SD大鼠的適應性和抗病性比較強,易于存活,故其常作為糖尿病動物模型的優先選擇。STZ是目前最常使用的糖尿病誘發性動物模型方法[9],其溶液制劑不穩定,研究顯示在配制STZ溶液時,要求枸櫞酸緩沖液的pH值為4.0-4.5,且要現配現用,從配制好的溶液到給大鼠注射完畢最好不要超過1 h[10, 11]。目前國內外對STZ造模的劑量的研究較多,小劑量為25-40 mg/kg,大劑量為50-65 mg/kg,STZ用量不同,可能與不同品系的大鼠及STZ在不同緩沖液中的穩定性有關。本研究選擇60 mg/kg體質量STZ單次腹腔注射,糖尿病造模成功率達82.5%,與文獻報道的數值接近[12]。

目前在動物模型中多采用機械性觸誘發痛和熱誘發痛對大鼠的痛覺進行測定。由于糖尿病神經病理性疼痛初期,大鼠溫度痛閾改變不明顯,故輻射熱刺激檢測糖尿病痛覺過敏存在它的局限性,因此本研究對大鼠的機械痛閾進行了動態觀察。本研究顯示糖尿病造模成功后第1周末,即注射STZ后10 d,大鼠的機械痛閾已明顯下降,且下降幅度隨時間的延長而逐漸增加,與文獻報道結果基本相符[13]。

背根神經節是初級傳入神經元胞體所在部位,能夠傳導痛覺,已經成為神經病理性疼痛發病機制研究的重點。前人研究[14-16]顯示,光鏡下正常組大鼠神經元形態未見明顯異常,呈多極狀,尼氏體清晰可見,呈斑塊狀或細粒狀散在均勻分布;而糖尿病組見部分神經元變性壞死,胞體腫脹,胞質著色淺,細胞由多極狀變為圓形,尼氏體溶解消失。本研究顯示電鏡下糖尿病組的背根神經節細胞出現明顯的病變,胞核、胞質內出現大量的空泡化,線粒體極度水腫,部分細胞壞死,這與前人的組織病理學改變是一致的。

糖尿病患者并發神經系統病變大多數是以周圍神經受累為主,其對神經系統的損傷最早從有髓和無髓小神經纖維開始,在動物實驗中多半選用腓腸神經標本作為病理觀察。有研究[17-20]顯示,光鏡下正常組神經纖維排列緊密、分布均勻,單個纖維飽滿,細胞結構完整,髓鞘著色均勻,可見半月形施旺細胞,而糖尿病組神經纖維排列松散、模糊,扭曲、形態不規則,髓鞘變薄,部分斷裂,密度不均勻,本研究顯示電鏡下糖尿病大鼠有髓神經纖維普遍出現明顯的脫髓鞘,髓鞘板層排列紊亂、腫脹,低倍電鏡下可見部分髓鞘溶解消失,這與前人光鏡下所見的髓鞘變化是相吻合的。長期的高血糖可以損害神經的血管屏障,髓鞘糖基化改變其抗原性,促進來自循環系統、組織及神經膠質細胞的單核巨噬細胞發揮其吞噬功能,然后激活免疫細胞分泌細胞因子如IL-1β和TNF-α,導致糖尿病神經病變的發生發展[21,22]。

本研究選用60 mg/kg體質量的STZ單次腹腔注射成功制備了大鼠Ⅰ型糖尿病模型,動態觀察了大鼠的一般狀態、血糖、痛閾及神經的病理改變,結果顯示隨糖尿病病程增加,大鼠的血糖呈進行性升高,痛閾逐漸降低,周圍神經病變逐漸加重,為糖尿病神經病理性疼痛早期干預治療的時間點選擇提供了參考依據。