miR-92b在子癇前期患者中的表達和意義

吳 穎,王 莉,葛 菲,溫云花,史 春

(1海口市婦幼保健院婦產科,海口 570203;2海南省人民醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:fenghuo58@163.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種在懷孕期間發生的綜合征,PE是孕產婦、新生兒和胎兒死亡的主要原因[1]。研究發現,胎盤血管形成障礙及母體內皮細胞損傷導致胎盤缺氧時產生的不同細胞因子可能是PE發生發展的始動因素[2]。目前,PE的致病分子機制尚未完全了解,因此難以監測疾病進展,微小RNA(microRNA,miRNA)可能是PE的潛在生物標志物或有效治療靶點[3],可為嚴重子癇前期的早期發現和診斷提供信息,為PE的監控和臨床管理提供了新的思路。miRNAs是一系列小的(18-24個核苷酸)內源性非編碼單鏈RNAs,可通過非完全配對6-8個核苷酸,于轉錄后水平調控靶mRNAs的表達,目標mRNA隨后通過形成RNA誘導的沉默復合物而降解,miRNA可以控制一系列不同的生物功能,包括細胞分化,增殖和凋亡[4-6]。在妊高征患者的胎盤中已經發現miRNA的高表達,表明它們可能在子癇前期中有其獨特的功能。這些miRNA包括miR-92b,miR-342-3p,miR-197,miR-25等[7,8],本研究擬使用逆轉錄-定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)在PE患者的血清中研究miR-92b的表達差異,并通過體外低氧模型的細胞增殖,探索細胞凋亡中miR-92b的表達及意義,為進一步研究PE生物標志物的病理生理機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及血清收集

選取2015-01～2017-12海南省人民醫院產科招募的60名子癇前期孕婦為研究組,60名健康孕婦志愿者為對照組。納入標準:年齡19-42歲,單胎妊娠,孕周35-40周。排除標準:在簽署知情同意書前6個月內患有腎病或原發性高血壓,有酒精或藥物濫用史,吸毒史的患者。每位入組者在首次入院時收集5 ml靜脈血。將血液吸入無抗凝血劑的無菌管中以收獲無細胞血清。試管保持靜置20 min后,在20 ℃和2 000 r/min下離心10 min,用移液管快速除去上清液,立即-80 ℃保存。本研究經本院倫理委員會批準,研究前簽署知情同意書。

1.2 細胞培養

人絨毛膜癌(JAR)細胞系購買自上海然泰生物科技有限公司。JAR細胞在含有高葡萄糖-Dulbecco改良的Eagle培養基并補充有10%胎牛血清(Hyclone;GE Healthcare Life Sciences,Logan,UT,USA)和1%青霉素/鏈霉素(Mediatech,Inc)的培養基中培養,培養基則置于5%CO2的潮濕氣氛的37 ℃培養箱內。缺氧處理方法將單細胞懸浮液中并接種到96孔板(1×104個細胞/孔)后,使用AnaeroPack系統(Mitsubushi Gas Chemical America,Inc.,New York,NY,USA)誘導JAR細胞低氧模型[8],設置6個重復,持續48 h,收集細胞記為缺氧組(n=6),同時收集未經缺氧處理的JAR細胞,記為對照組(n=6),進行后續實驗。

1.3 real-time PCR

使用TRIzol試劑提取研究組(n=60)和對照組(n=60)孕婦血清、對照組(n=6)和缺氧組(n=6)細胞總RNA,隨后用75%乙醇代替異丙醇進行RNA沉淀。使用NanoDrop 1000分光光度計測定RNA質量。以DBI Bestar qPCR RT試劑盒(DBI Bioscience,Ludwigshafen,德國)將總共1 μg RNA反轉錄成cDNA。使用7500 Fast Real-Time PCR儀進行RT-PCR,檢測血清和細胞中miR-92b的表達。20 μl PCR反應包括1 μl逆轉錄產物(1 ∶5),上下游引物各0.5 μl和10 μl DBI-2043Bestar?實時PCR主混合物。引物序列見表1。將反應物在96孔光板中于94 ℃溫育2 min,然后進行94 ℃ 20 s,8 ℃ 20 s和72 ℃ 20 s的40個循環。使用2-ΔΔCt公式對miRNA進行定量。

表1 PCR引物序列

Table 1 PCR primer sequences

基因引物序列miR-92b上游引物:5′-TATTGCACTCGTCCCGGCCTCC-3′下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′

1.4 細胞增殖實驗

使用Lipofectamine 2000將miR-92b mimics及其相應對照(上海吉瑪基因化學科技有限公司)轉染到缺氧預處理后的JAR細胞中,分別記為miR-92b mimics組(n=6)和control組(n=6),然后在37 ℃下在不含FBS的DMEM中孵育48,72,96 h。在各孔中加入100 μl Cell Counting Kit-8溶液(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Kumamoto,Japan),并在37 ℃下完成孵育1 h,使用酶標儀在450 nm處測量吸光度(OD450 nm)以描述細胞增殖情況。

1.5 Western blot檢測cleaved caspase 3、Bcl2、Bax表達

在缺氧環境中對JAR細胞轉染miR-92b mimics及其相應對照 48 h,分別記為miR-92b mimics組(n=6)和control組(n=6),提取兩組細胞的總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將各組蛋白與Loading buffer充分混合后100 ℃煮沸5 min變性,每孔50 μl加入到SDS-PAGE凝膠上樣孔中進行電泳和轉膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入按使用說明稀釋后的待測一抗4 ℃過夜[待測一抗包括:cleaved caspase 3(1 ∶1 000)、Bcl2(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶1 500)]。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1 ∶1 000稀釋)。37 ℃孵育1 h,TBST清洗后以ECL發光液顯影,以自動凝膠成像系統采集圖像,以GAPDH為內參分析各蛋白表達水平。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 一般臨床資料比較

兩組入選者在年齡、體質量、凝血酶原時間、活化部分凝血凝血活酶時間、凝血酶時間、尿素氮方面無明顯統計學差異(P>0.05),而子癇前期孕婦的收縮壓和舒張壓顯著高于對照組,生產時妊娠周數、肌酐、新生兒體質量、24 h尿蛋白也明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 研究組與對照組臨床特征和實驗室檢查結果比較

Table 2 Clinical features and laboratory examination results of the study group and the control group

臨床特征研究組(n=60) 對照組(n=60) P年齡(歲) 28.96±5.12 29.63±3.690.439體質量(kg) 68.55±8.29 68.14±7.630.910體質量指數(kg/m2) 29.20±1.90 26.95±1.200.038確診PE時妊娠周數(周) 31.20±3.03 --生產時妊娠周數(周) 35.20±3.21 38.90±1.230.000收縮壓(mmHg) 156.12±11.35 114.90±9.350.000舒張壓(mmHg) 100.01±9.32 69.30±6.380.000凝血酶原時間(s) 11.35±0.61 11.52±0.900.493活化部分凝血活酶時間(s) 28.31±3.83 28.81±3.550.630凝血酶時間(s) 16.88±2.31 16.24±0.850.620血紅蛋白(g/L) 111.63±12.36 114.96±11.310.393尿素氮(mmol/L) 4.29±1.50 3.59±1.010.099肌酐(μmol/L) 58.26±16.34 42.29±6.620.000新生兒體質量(g)2489.51±658.353270.00±392.230.00024 h尿蛋白(mg)2061.45±1960.13 109.31±39.20.000

2.2 研究組與對照組血清miR-92b水平比較

與對照組相比,研究組血清miR-92b表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

2.3 缺氧處理后JAR細胞miR-92b表達水平變化

缺氧處理后JAR細胞與對照細胞相比,miR-92b表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖2)。

2.4 miR-92b對細胞增殖的影響

以miR-92b mimics轉染細胞后48,72,96 h,JAR細胞在缺氧環境中細胞增殖均較轉染對照的control組明顯增加(P<0.05,見圖3)。

與對照組比較,*P<0.05圖1 研究組與對照組血清miR-92b水平比較Figure 1 Comparison of serum mir-92b levels between study group and control group

與對照細胞對比,*P<0.05圖2 缺氧處理后JAR細胞與對照細胞miR-92b水平比較Figure 2 Comparison of mir-92b levels between hypoxic JAR cells and control JAR cells

與control組對比,*P<0.05圖3 miR-92b表達對JAR細胞增殖的影響Figure 3 Effect of mir-92b expression on the proliferation ability of JAR cells

2.5 miR-92b對凋亡相關蛋白cleaved caspase 3、Bcl2/Bax表達的影響

缺氧環境中miR-92b mimics組JAR細胞較control組cleaved caspase 3、Bax表達降低、Bcl2表達增加(見圖4)。

圖4 miR-92b對凋亡蛋白cleaved-caspase 3、Bcl2/Bax的影響Figure 4 Effect of miR-92b on apoptotic protein cleaved-caspase 3, Bcl2/Bax

3 討論

導致子癇前期的分子機制尚不清楚。研究者們認為,miRNA可能是潛在的子癇前期的生物標志物,本研究驗證了妊娠期間子癇前期患者與健康對照組血清miR-92b表達差異,隨后研究miR-92b對缺氧微環境下人絨毛膜癌細胞(JAR)增殖和凋亡的影響。PE患者中miR-92b的表達水平出現了明顯降低,進一步的研究證明,miR-92b mimics組缺氧微環境中JAR細胞的增殖能力增加,凋亡相關蛋白cleaved caspase 3、Bax表達降低,抗凋亡蛋白Bcl2表達增加。本研究結果提示,高水平的miR-92b可以增加缺氧環境下細胞存活率,血清miR-92b表達缺失可能是PE發生發展的生物標志物。

miR-92b的功能十分復雜,在惡性腫瘤中,miR-92b表達升高所造成的抗凋亡、促進細胞存活的作用可能是腫瘤細胞惡性轉化的原因之一,因此,在子宮內膜癌、胃癌、乳腺癌等實體瘤中常常出現miR-92b的異常表達[9,10]。但是在心血管疾病中,miR-92b的過表達對于心肌細胞具有明顯的保護作用,減少缺氧誘導的心肌細胞死亡[11,12],在不同疾病中miR-92b表達的意義完全不同,本研究的結果支持miR-92b可能成為PE良好預后的潛在生物標志物的可能性,針對提高miR-92b的治療方法可能成為改善PE患者臨床結果的新方法。

miRNA通常靶向基因的3′非翻譯區,并導致靶基因表達的降低或者喪失。在既往的研究中,有人提出fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)和胎盤生長因子(placental growth factor,PIGF)的比例可能是子癇前期的另一種診斷或預測工具[13,14]。薈萃分析顯示,母親出現子癇前期的孕婦胎盤sFlt1濃度升高,PIGF濃度降低。而且,發生嚴重子癇前期的女性血管內皮生長因子水平明顯降低,胎盤細胞出現明顯的缺氧性改變[15],miR-92b作為影響細胞缺氧抗性的miRNA,可能對sFlt-1或PIGF的表達具有一定的調控作用。在PE期間miR-92b與上述mRNA的調控關系以及miR-92b可能的靶基因的尋找還需進一步研究。

綜上所述,本研究表明在PE患者的臨床血清樣品中miR-92b的表達顯著下調。通過其特異性模擬物上調miR-92b,發現JAR細胞增殖能力增加,凋亡蛋白表達降低。miR-92b表達缺失可能在PE過程中調控細胞增殖和凋亡影響PE的發展和演進,外源性上調miR-92b可能是阻礙PE發生發展的可能途徑之一。