過敏性紫癜患兒外周血miR-155表達及與Th17/Treg平衡的關系

白濤敏,王潔英,劉 娜,李 瑞

(陜西省人民醫院兒科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:wangjieying@163.com)

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一種常見的免疫性炎癥疾病,多發于兒童時期。普遍認為,過敏性紫癜患兒體內免疫功能紊亂與其病理、臨床表現等關系密切[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為18-25個核苷酸的內源性非編碼RNA,可調控細胞增殖和分化等過程,參與多種疾病的發展過程。研究發現,miR-155可通過介導炎癥反應、抗原提呈、T細胞分化等過程影響免疫反應[2]。Th17細胞分化依賴于miR-155,miR-155敲低的T細胞不能正常分化為Th17,研究證實,過敏性紫癜患兒外周血Th17/Treg失衡,參與該疾病的發生和發展[3]。本研究初步探討miR-155能否通過調控Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜的發生、發展。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016-04～2017-10本院接收診治的79例過敏性紫癜患兒為研究對象,其中男42例,女35例,年齡2-13歲,平均年齡(7.59±4.16)歲。納入標準:①符合過敏性紫癜患兒的診斷標準[4];②首次發病;③未使用任何糖皮質激素等藥物。另選取同時期在本院體檢的60例健康兒童作為對照,其中男34例,女26例,年齡2-14歲,平均年齡(7.81±4.37)歲。過敏性紫癜患兒和對照組在年齡、性別等方面無顯著差異,具有可比性。本研究經本院病理委員會批準同意,患者家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑和儀器

FACS Calibur流式細胞儀,Becton Dickimn公司。DU-800型紫外分光光度計,美國貝克曼庫爾特公司。Trizol試劑,Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自Fermentas公司。引物由北京奧科公司設計并合成。白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集 采集所有受試者清晨空腹靜脈血6 ml,置于抗凝管中,分為2管,每管3 ml。取其中一管,采用密度梯度離心法分離單核細胞,用于檢測Th17和Treg細胞比例。另一管離心(4 ℃,3 500 r/min,10 min),取上層血清,-20 ℃保存備用。

1.3.2 流式細胞術檢測Th17和Treg細胞比例 參考文獻方法[5],采用EPICS-XL流式細胞儀檢測外周血Th17和Treg細胞。

1.3.3 qRT-PCR檢測血清 采用Trizol法提取血清中總RNA,分光光度計檢測RNA濃度和純度。RNA溶液在260 nm和280 nm處吸光值的比值大于1.8。嚴格參照逆轉錄試劑盒操作說明,將RNA逆轉為cDNA,以cDNA為模板進行擴增。引物序列見表1。反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,總共進行45個循環,72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法,以U6作為內參計算miR-155相對表達水平,以GAPDH為內參,計算RORγt和Foxp3 mRNA的相對表達水平。

1.3.4 酶聯免疫吸附法檢測相關細胞因子表達 取1.3.1中收集的血清,采用酶聯免疫吸附法分別按照IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和TGF-β1試劑盒說明書檢測其表達水平。

表1 引物序列

Table 1 The primer sequences

引物 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′)U6CACTGGGCCATGCTAATCTTCTCGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-155CGAGAGGTAACATTCAACGCTGTCGTGCAGGGTCCGTGGAGAPDHTGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGTGGTGAAGACGCCAGTAGRORγtGCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCGFoxp3GCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCG

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 過敏性紫癜患兒和對照組外周血miR-155表達比較

過敏性紫癜患兒和對照組外周血miR-155表達水平分別為1.79±0.08和1.03±0.02。與對照組相比,過敏性紫癜患兒外周血miR-155表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.2 過敏性紫癜患兒和對照組Th17和Treg細胞比例比較

與對照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞比例顯著升高(P<0.05),Treg細胞比例顯著降低(P<0.05,見表2)。

組別nTh17細胞Treg細胞對照組600.49±0.184.86±0.73HSP組791.26±0.432.35±0.57 t13.02222.767 P0.0000.000

2.3 過敏性紫癜患兒和對照組Th17和Treg細胞相關轉錄因子比較

與對照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞轉錄因子RORγt顯著升高(P<0.05),Treg細胞轉錄因子Foxp3顯著降低(P<0.05,見表3)。

組別nRORγtFoxp3對照組601.06±0.021.04±0.03HSP組791.84±0.080.47±0.01 t73.734157.873 P0.0000.000

2.4 過敏性紫癜患兒和對照組Th17和Treg細胞相關的細胞因子比較

與對照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞相關細胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均顯著升高(P<0.05),Treg細胞相關細胞因子IL-10和TGF-β1均顯著降低(P<0.05,見表4)。

2.5 過敏性紫癜患兒miR-155表達與各檢測指標相關性

過敏性紫癜患兒外周血miR-155與Th17細胞比例、轉錄因子RORγt以及相關細胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相關(P<0.05),與Treg細胞比例、轉錄因子Foxp3以及細胞相關因子IL-10和TGF-β1均呈負相關(P<0.05,見表5)。

組別nIL-6IL-17IL-22IL-23IL-10TGF-β1對照組603.15±0.426.59±3.166.13±3.4835.21±10.2589.46±20.1787.39±11.54HSP組795.29±0.6726.19±12.4319.38±7.6847.39±12.5854.19±14.2851.08±8.13 t-21.70311.91612.4226.11412.06721.756 P-0.0000.0000.0000.0000.0000.000

表5 過敏性紫癜患兒miR-155表達與各檢測指標相關性

Table 5 Correlation between the expression of microRNA-155 and the detection indexes in children with Henoch-Schonlein purpura

指標 miR-155 rPTh17細胞0.4670.023RORγt0.5730.012IL-60.4920.018IL-170.5190.015IL-220.3710.041IL-230.3860.034Treg細胞-0.4910.019Foxp3-0.5760.011IL-10-0.6150.006TGF-β1-0.5830.009

3 討論

miR-155是由23個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA,定位于人21號染色體,高表達于人胸腺、脾臟、肺等富含免疫細胞的器官。郭瑩等[6]研究發現,免疫性血小板減少癥患者外周血CD19+B細胞中miR-155表達水平明顯上調,并且與B淋巴細胞功能和細胞內抗體的產生密切相關,參與免疫性血小板減少癥的發病過程。Johansson等[7]研究發現,miR-155敲低的過敏性氣道炎癥小鼠表現出較低的炎癥水平,miR-155是過敏性氣道炎癥中2型固有淋巴細胞和IL-33信號傳導的關鍵調節因子。本研究結果顯示,過敏性紫癜患兒外周血miR-155表達水平較對照組也顯著升高,提示miR-155可能參與過敏性紫癜的發病過程。

Th17和Treg細胞均屬于CD4+細胞亞群,Th17細胞可分泌IL-17等炎癥細胞因子,促進機體內單核巨噬細胞等產生更多的趨化因子及炎癥細胞因子,從而介導機體產生炎癥反應以及自身免疫性疾病的發生[8]。RORγt作為Th17細胞的特異性轉錄因子,可調控Th17細胞的分化與功能。RORγt可與活化T細胞因子相互作用,抑制IL-2的生成,間接地促進Th17細胞表達。Foxp3是Treg細胞的特異性轉錄因子,轉化生長因子TGF-β通過誘導Foxp3蛋白的表達,進而維持Treg細胞的數量和功能。機體內過量的IL-6不僅能夠抑制TGF-β誘導的Foxp3表達,還能夠促進RORγt表達,進而促進CD4+細胞分化為Th17細胞。Th17/Treg平衡是機體維持免疫穩態的重要因素,在多種炎性疾病和免疫性疾病中被廣泛關注。張玲等[9]研究發現,過敏性紫癜患兒外周血Th17、Treg細胞及其關鍵調控因子IL-6、TGF-β等水平均較健康對照表達異常,Th17/Treg平衡失調可能參與該疾病的發病過程。本研究結果顯示,與對照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細胞比例、轉錄因子RORγt、相關細胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23顯著升高,而Treg細胞比例、轉錄因子Foxp3、相關細胞因子IL-10和TGF-β1顯著降低,與相關報道結果一致,提示過敏性紫癜患兒外周血Th17/Treg細胞呈平失調狀態,通過調節Th17/Treg平衡可能為過敏性紫癜的治療提供新方法或新思路。

Th17細胞的分化依賴于miR-155表達,多種免疫相關性疾病中miR-155表達異常與Th17細胞分化異常相關。Zhang等[10]研究發現,miR-155敲除的小鼠T細胞尤其是Th17細胞介導的炎癥反應顯著減弱,miR-155調節慢性心臟排斥反應中Th1/Th17相關的炎癥,可能是減弱心臟移植排斥反應的潛在治療靶點。本研究結果顯示,miR-155與Th17細胞比例、RORγt、IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相關,與Treg細胞比例、Foxp3、IL-10和TGF-β1均呈負相關,猜測miR-155也可能通過調節Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜發生過程,是該疾病的潛在治療靶標。

綜上所述,過敏性紫癜患兒外周血miR-155過表達,Th17/Treg細胞失衡,miR-155與Th17細胞及相關細胞因子呈正相關,與Treg細胞及相關細胞因子呈負相關,miR-155可能通過調節Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜發生過程,是治療過敏性紫癜的新靶點。