RNR3啟動子調控的紅綠熒光蛋白雙信號發光酵母細胞對化學誘變原的篩選

姚 佳，劉 星，盧光玉，朱方渝，吳倩倩，李湘鳴，*

(1.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225001；2.揚州市衛生監督所，江蘇 揚州 225002；3.蘇州市相城人民醫院，江蘇 蘇州 215100)

核糖核苷酸還原酶是生物體內唯一的催化4種核糖核苷酸還原、生成相應的脫氧核糖核苷酸的酶。該酶是DNA合成和修復的關鍵酶和限速酶，對細胞的增殖和分化起著調控作用。RNR3屬于核糖核酸還原酶(ribonucleotidereductase，RNR)中的一員，在正常生長條件下，酵母細胞中的RNR3基因處于封閉狀態，當誘變原造成DNA損傷或合成阻斷時，可誘導該基因的大量表達。本實驗室曾將RNR3基因啟動子與某報告基因(如yEGFP，LacZ等)相融合，構建成重組酵母細胞，用于對化學誘變原的篩選[1]，但是在試驗過程中發現報告基因的表達強度多數需用D(600)或蛋白含量進行校正，在操作時，必須將細胞濃度進行適當稀釋，使D(600)位于0.2～0.5之間[2]，否則誤差較大，故操作不方便。

DsRed-Express-2是紅色熒光蛋白(DsRed)的突變體，具有成熟快的特點，最大吸收波長和發射波長分別為558和583nm，因此可用其作為“內參比”，轉化于RNR3調控的yEGFP發光酵母細胞，用于校正因受試物的細胞毒性作用對yEGFP發光強度的影響。當化學物誘變原作用于酵母細胞使其DNA損傷或合成阻斷時，會經RNR3使yEGFP基因大量表達，通過檢測yEGFP和DsRed-Express2熒光強度，其相對發光度(即yEGFP/DsRed-Express2比值)與化學誘變原間存在著劑量-效應關系。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

所用化學誘變原購自美國Sigma公司；倒置熒光顯微鏡(尼康Ti-U)由日本Nikon公司生產，多功能酶標儀(Bio-TekSynergy2)由美國伯騰公司生產。

1.2 RNR3啟動子調控的綠熒光蛋白雙信號發光酵母細胞的建立

將RNR3啟動子調控的yEGFP發光細胞(W303-1A/RNR3-yEGFP)[1]劃線接種于缺乏尿嘧啶(SD/-ura)的選擇性培養板上，30℃培養3～4d，生長出直徑為3～4mm的克隆。從SD/-ura培養板挑取W303-1A/RNR3-yEGFP的克隆，用醋酸鋰方法將pGPD-DsRed-Express2(本實驗室構建)[3]轉化于感受態酵母細胞W303-1A/RNR3-yEGFP，用SD/-trp,-ura選擇性培養板篩選陽性克隆。挑取細胞克隆，分別制成細胞懸液，置于倒置熒光顯微鏡下，分別在藍色和綠色光激發下觀察細胞的發光強度，選取可發出綠光和紅光的酵母克隆，命名為W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2。

1.3 RNR3調控的雙信號發光酵母細胞對誘變原的篩選研究

挑取重組酵母細胞(W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2)克隆，接種于5mLSD/-trp,-ura培養液中，30℃振蕩培養過夜。取振蕩培養過夜酵母培養液2mL，加入SD/-trp,-ura10mL，混勻，取100 μL加入到96孔黑色酶標板中，選取以下化學誘變原進行研究，每種化學誘變原設12個濃度組，濃度梯度呈2倍稀釋。①與DNA發生結合的誘變原，放線菌素(actinomycinD)和溴乙錠(ethidiumbromide)；②使DNA發生烷基化的誘變原，絲裂霉素C(mitomycinC)、甲磺酸甲脂(methylmethanesulfonate，MMS)和瘤可寧(chlorambucil，苯丁酸氮芥)；③使DNA發生斷裂的誘變原，順鉑(cis-Platinum)、4-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-N-oxide， 4-NQO)、 博 來 霉 素(bleomycin)和福來霉素(phleomycin)；④抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil， 5-FU)、 羥 基 脲 (hydroxyurea)、 喜 樹 堿(camptothecin)和阿非迪霉素(aphidicolin)；⑤其他生物毒性作用的化合物，秋水仙堿(colchicine)、刀豆氨酸(canavanine)和四環素(tetracycline)。選用各自受試物的溶劑作為空白對照。溶液加入體積不超過總體積的2%。將96孔黑色酶標板用保鮮膜密封，于30℃振蕩培養12h，用多功能酶標儀(Bio-TekSynergy2)檢測綠色熒光蛋白(yEGFP)(激發波長485nm，發射波長528 nm，帶寬20nm)和紅色熒光蛋白(DsRed-Express-2)(激發波長555nm，發射波長585nm，帶寬20nm)的發光強度(luminousintensity，l)。

1.4 統計方法

用Excel軟件計算相對熒光強度(relative fluorescence，RF)，即 yEGFP 與 DsRed-Express-2 之比。用RF表示酵母發光強度與受試物的劑量效應關系，并求誘導倍數(foldincuction，FI)，即受試組與空白對照組的相對發光度之比。當FI≥1.5倍以上，且受試物與RF具有明顯的劑量效應關系時，可判斷受試物為陽性。

細胞毒性判斷：試驗前首先測各空白對照組的DsRed-Express-2發光度(lDsRed-Express-2，對照組)，求 xˉ和s，以xˉ-1.64s作為判斷界值。當受試物組的DsRed-Express-2發光度(lDsRed-Express-2，受試物)低于該界值時，則判斷受試物對細胞產生明顯的毒性。本文經研究確定l=500cd作為判斷標準。

2 結果

2.1 yEGFP和DsRed-Express-2發光效果

圖1為W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2酵母細胞在倒置熒光顯微鏡下的觀察效果，可見分別在藍色和綠色光激發下，細胞發出綠光和紅光，說明雙發光重組酵母細胞構建成功。

圖1 yEGFP和 DsRed-Express-2在RNR3啟動子調控的酵母細胞中表達

2.2 雙發光重組酵母細胞對與DNA發生結合誘變原的篩選

與DNA發生結合的誘變原(放線菌素D和EB)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應關系見表1，可見在受試濃度范圍內，隨著誘變原濃度的升高，DsRed-Express-2發光度未見明顯下降，說明未對細胞產生明顯的毒性作用，同時也未對yEGFP產生明顯的誘導作用，FI均在1.5以下。

表1 與DNA發生結合的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

表1 與DNA發生結合的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

放線菌素D濃度/(μg/L)0 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200 400 lDsRed-Express-2 9589.0±403.4 8737.3±758.7 8710.3±633.0 8966.3±899.9 9340.0±1233.1 9221.3±926.9 8923.3±1080.4 8863.0±1601.1 9066.7±1130.2 8921.3±1700.9 9032.7±2152.1 9286.7±3478.0 FI 1.00±0.00 1.14±0.11 1.13±0.09 1.12±0.14 1.10±0.17 1.10±0.12 1.15±0.08 1.19±0.16 1.15±0.10 1.17±0.16 1.14±0.26 1.16±0.49 EB濃度/(μg/L)0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 lDsRed-Express-2 9066.0±182.4 8640.7±396.3 8335.7±532.1 8571.7±717.1 8651.7±839.1 8440.3±656.7 8779.3±1302.0 8401.3±619.4 8873.7±550.4 9603.3±496.9 10816.0±380.1 12595.7±15.3 FI 1.00±0.00 1.06±0.06 1.11±0.08 1.09±0.08 1.11±0.10 1.14±0.07 1.19±0.20 1.32±0.08 1.37±0.07 1.35±0.06 1.30±0.02 1.25±0.03

2.3 雙發光重組酵母細胞對使DNA發生烷基化誘變原的篩選

表2為與DNA發生烷基化的誘變原(絲裂霉素C、MMS和瘤可寧)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應關系。可見絲裂霉素C在整個受試濃度范圍內，未對yEGFP產生明顯的誘導作用，FI接近于1(在0.94-1.09的范圍內波動)；而MMS和瘤可寧卻不同，對yEGFP產生明顯的誘導作用，MMS的FI明顯高于瘤可寧，前者為4.12，而后者為2.80。但是，瘤可寧在最高濃度組對細胞呈現毒性作用，表現為DsRed-Express-2發光度明顯降低，但仍大于500 cd。

表2 使DNA發生烷基化的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

表2 使DNA發生烷基化的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

絲裂霉素C濃度/(μg/L)0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 lDsRed-Express-2 8604.0±286.1 8368.3±553.5 8801.0±838.1 8427.3±1034.3 8591.7±787.1 8642.7±1119.0 8540.7±1013.6 8162.7±890.7 8599.3±833.1 8680.0±951.0 8726.0±877.4 8661.0±310.5 FI 1.00±0.00 1.06±0.04 1.03±0.07 1.07±0.10 1.07±0.08 1.12±0.11 1.09±0.10 1.08±0.10 1.04±0.08 1.02±0.07 0.98±0.06 0.94±0.06 MMS濃度/(μg/L)0 0.4 0.8 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50 100 200 400 lDsRed-Express-2 9283.0±103.6 8709.0±667.9 8920.0±794.2 8596.0±173.9 9290.0±875.5 8917.3±846.2 8770.3±511.5 9040.3±476.7 7967.3±1617.8 8679.7±841.1 9447.0±559.1 8295.0±2658.2 FI 1.00±0.00 1.10±0.05 1.07±0.07 1.16±0.13 1.03±0.09 1.09±0.13 1.11±0.07 1.35±0.26 1.40±0.29 1.30±0.14 3.68±0.22 4.12±0.92瘤可寧濃度/(μg/L)0 0.20 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 9916.7±256.7 9366.0±206.2 9544.0±569.2 9503.3±796.4 9965.3±1218.1 10054.7±1611.1 10092.7±487.5 9668.3±946.0 8157.0±3107.7 7475.0±3505.7 6243.3±2466.0 2920.7±981.8 FI 1.00±0.00 1.05±0.01 1.02±0.06 1.04±0.06 0.98±0.14 0.98±0.20 0.94±0.06 0.98±0.09 1.29±0.58 1.49±0.91 1.62±0.71 2.80±1.12

2.4 雙發光重組酵母細胞對使DNA發生斷裂誘變原的篩選

表3為使DNA發生斷裂的誘變原4-NQO、順鉑、博來霉素和福來霉素與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2劑量效應關系。可見4-NQO與重組酵母有明顯的劑量效應關系，在0.08μg/mL以上時，FI開始升高，最高達4.69；雖然在5μg/mL以上組時，FI升高非常明顯，但是，DsRed-Express-2卻明顯下降，平均發光度低于空白水平，因此，這種FI的升高變化，并非是4-NQO的誘導作用，而是兩種熒光蛋白本底“噪聲”的變化所致。在不同濃度的順鉑、博來霉素和福來霉素作用下，未發現雙信號發光酵母細胞與其有明顯的劑量效應關系，也未發現對細胞產生明顯的毒性，但是，福來霉素的DsRed-Express-2發光度普遍偏低，可能是該受試物溶劑對細胞的生長有一定的抑制作用。

表3 使DNA發生斷裂的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

表3 使DNA發生斷裂的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

4-NQO濃度/(μg/L)0 0.02 0.04 0.08 0.16 0.32 0.62 1.26 2.5 5 10 20 lDsRed-Express-2 3936.0±234.3 3914.3±139.0 3934.3±52.3 3729.3±65.5 3006.7±172.0 2331.3±112.2 1476.0±46.9 874.3±73.4 567.0±31.0 447.7±12.9 479.3±2.1 410.3±30.8 FI 1.00±0.00 0.99±0.11 0.97±0.08 1.01±0.07 1.21±0.14 1.51±0.03 2.15±0.10 3.18±0.41 4.69±0.51 5.74±0.59 5.32±0.41 6.47±0.89濃度/(μg/L)0 0.2 0.5 1.0 2.0 4 8 1 6 31 62.5 125 250順鉑lDsRed-Express-2 19088.3±391.7 18412.0±1117.2 18091.0±1021.8 18786.0±1661.7 18878.3±1492.7 19248.0±2740.2 18925.0±2568.0 19975.±2341.3 19682.3±1778.3 20086.7±1227.0 20684.0±992.0 20008.0±993.4 FI 1.00±0.00 1.03±0.04 1.04±0.03 1.01±0.08 1.01±0.08 1.01±0.13 1.06±0.12 1.01±0.12 1.02±0.09 1.03±0.07 1.01±0.08 1.10±0.10博來霉素濃度/(μg/L)0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 lDsRed-Express-2 10926.0±753.7 9647.0±1006.3 9500.0±893.5 9379.0±968.6 9196.7±1047.9 9609.0±1508.3 9676.7±1307.5 9532.7±911.4 9399.0±809.5 9415.7±801.7 8858.7±527.5 8505.7±211.2 FI 1.00±0.00 1.13±0.04 1.12±0.06 1.14±0.05 1.13±0.02 1.13±0.11 1.10±0.08 1.15±0.07 1.20±0.06 1.22±0.05 1.31±0.01 1.32±0.07福來霉素濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 716.0±24.6 738.7±17.2 733.7±13.6 731.0±6.6 735.0±13.0 709.0±9.5 717.7±14.5 744.7±14.2 748.7±9.3 747.7±14.4 744.3±30.7 706.0±10.8 FI 1.00±0.00 1.01±0.11 1.00±0.11 0.99±0.14 1.16±0.22 1.03±0.16 1.01±0.17 0.99±0.16 1.00±0.17 0.98±0.17 0.97±0.18 1.01±0.03

2.5 雙發光重組酵母細胞對抑制DNA合成酶或拓撲異構酶誘變原的篩選

表4為抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原(5-FU、喜樹堿、阿非迪霉素和羥基脲)與W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2的劑量效應關系。由表可見，不同濃度的5-FU作用于雙信號發光酵母細胞后，0.5μg/mL以上組的FI均達2.00以上，但升高速度緩慢，最高為4.08，也未發現對細胞產生明顯的毒性作用。喜樹堿、阿非迪霉素和羥基脲作用下，在受試濃度范圍內未發現與重組酵母細胞有明顯的劑量效應關系，各濃度組FI均在1.5以下，DsRed-Express-2發光度變化比較穩定，標準差變化不大，均小于1/2均數，說明未對細胞產生明顯的毒性作用。

表4 抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

表4 抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

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2.6 雙發光重組酵母細胞對其他生物化學毒性作用化合物的篩選

表5為重組雙信號發光酵母細胞在非基因毒性化合物(秋水仙素、四環素和刀豆氨酸)的作用下，在受試濃度范圍內未發現與FI有劑量效應關系，也未發現對DsRed-Express-2發光度產生明顯的影響。雖然四環素在最高濃度組(200μg/mL)FI大于1.5，為1.89，但是，其他各濃度組FI均低于1.5，并呈隨機波動。這可能是在高濃度情況下，四環素中的某些佐劑所產生的熒光所致。

表5 其他生物化學毒性作用的化合物對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

表5 其他生物化學毒性作用的化合物對W303-1A/RNR3-yEGFP/DsRed-Express-2發光度的影響

秋水仙素濃度/(μg/L)0 0.5 1 2 4 8 1 6 31 62.5 125 250 500 lDsRed-Express-2 16764.3±338.3 16176.3±228.2 15779.3±527.2 16348.3±149.8 16515.7±85.0 16479.0±856.6 16953.7±701.1 17412.7±1258.7 17491.3±1076.9 17528.0±854.5 17977.0±1225.1 21315.7±394.8 FI 1.00±0.00 1.05±0.06 1.13±0.13 1.01±0.06 0.99±0.05 1.01±0.05 0.98±0.08 0.94±0.06 0.94±0.07 0.93±0.02 0.92±0.07 0.76±0.04四環素濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 20163.0±1457.7 18210.3±1028.0 17672.0±723.7 17382.3±830.4 17667.0±664.4 16841.3±966.9 17436.0±537.6 16802.0±112.3 16948.0±321.1 16512.3±396.7 16727.7±577.9 16390.7±798.7 FI 1.00±0.00 1.10±0.08 1.15±0.11 1.16±0.09 1.13±0.07 1.25±0.08 1.18±0.09 1.30±0.17 1.25±0.12 1.37±0.18 1.46±0.19 1.89±0.28刀豆氨酸濃度/(μg/L)0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.25 12.5 25 50 100 200 lDsRed-Express-2 18603.7±1124.3 17639.0±622.5 18216.3±1335.1 19058.7±2062.7 19281.0±2048.2 19979.0±2300.1 19806.0±1402.7 19536.0±1345.3 19980.3±1037.0 20597.0±903.5 21000.7±1078.2 20775.3±5317.8 FI 1.00±0.00 1.03±0.06 1.02±0.08 0.95±0.05 0.95±0.06 0.91±0.05 0.91±0.01 0.93±0.02 0.92±0.04 0.89±0.04 0.91±0.02 1.01±0.35

3 討論

目前現行的化學物質遺傳毒性體外測試方法有Ames實驗、SOS和SOS/umu顯色反應、Comet分析法、程序外DNA合成實驗、V79/HGPRT基因突變分析法和哺乳細胞轉化實驗等一系列[4-9]，可概括為原核細胞和真核高等生物細胞實驗兩大類。在原核細胞實驗中，Ames、SOS和SOS/umu應用較多，特別是Ames實驗得到非常廣泛地應用，也是我國化學物安全評價標準首選項目。但是，原核細胞除了所需菌種較多、假陽性高、操作十分繁瑣外，主要原因是其基因結構、基因調控和代謝與真核細胞有相當大的不同，因此，原核細胞用于化學物質的致突變性篩選時，具有一定的局限性。高等生物細胞雖無基因結構、調控和代謝方面的局限性，但是，其培養條件復雜，對化學物的毒性抵抗力差，故選用高等生物細胞也無法對化學物的遺傳毒性進行快速、自動化、高通量的體外篩選。

酵母是單細胞低等真核生物細胞，不僅具有易培養、繁殖、生長條件要求不高、對環境有害化學物抵抗力較強等特點外，而且具有遺傳背景清楚、基因結構、基因調控、代謝和蛋白質翻譯后加工與哺乳動物細胞相似等特點[10-12]。所以，將DNA重組技術、基因表達技術和酵母細胞的生物學特點相結合，構建成重組酵母細胞，用于快速、高通量篩選化學誘變原，是理想的選擇，也具有良好的發展應用前景。化學誘變物作用酵母細胞造成DNA損傷或是合成阻斷時，通過各種基因調控作用，可誘導多個基因的轉錄表達。在所誘導的特殊基因的轉錄中，最受關注的是RNR3、RNR2、RAD54和MAG1[13-18]。正常生長條件下，細胞中幾乎檢測不到RNR3、RNR2、RAD54和MAG1的表達。RNR3屬于核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase，RNR)系統的一員，其中RNR1和RNR3編碼該酶的大亞基，RNR2和RNR4編碼小亞基[19-20]，DNA斷裂損傷時及合成阻斷時可誘導RNR3等相關基因的表達[21-23]。

因此，國外有研究者將RNR3等相關基因啟動子與蟲熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)基因相串聯，轉染于酵母細胞，構建成重組酵母細胞，用于化學誘變原的篩選[24-25]。當化學誘變物作用于酵母細胞時，報告基因會發光，發光強度與誘變原間存在著劑量-效應關系。但是，用蟲熒光酶作為報告基因雖然較敏感，但不適合我國國情，原因是：①成本較高。它必須采用蟲螢光素酶和海腎螢光素酶兩個報告基因，這是因為誘變原相關基因啟動子調控的蟲熒光酶發光度，不僅與受試物的誘導有關外，還與細胞的數量和活性狀態有關，因此必須用海腎螢光素酶發光度校正其影響。兩者酶的底物較昂貴；②操作繁瑣。蟲熒光素酶和海腎熒光素酶是在細胞內表達，其底物無法進入細胞，必須對細胞壁加以裂解，因而操作繁瑣，難以達到自動化、高通量。而采用綠色熒光蛋白(yEGFP)基因可克服蟲熒光素酶報告基因的某些缺點。

當化學誘變原作用于重組酵母細胞時，對DNA的損害必然會發生累加效應，因此，yEGFP的發光程度，除了與化學誘變原的作用強度有關外，還與作用時間有關。但是，隨著作用時間延長，化學誘變原的降解也會加速。結合不同化學誘變原的理化屬性，我們研究發現平均作用時間為12h效果較理想。當誘變原作用于酵母細胞時，同時會使細胞數量和活性狀態發生變化，所以，yEGFP的發光度需進行校正。雖然綠色熒光蛋白(GFP)基因可克服蟲熒光素酶報告基因的某些缺點，但國內外學者多采用D(600)值來校正發光度以校正細胞數量和狀態對yEGFP發光度的影響。由于D(600)只能說明活細胞數和死細胞數總數量，無法恒量細胞的狀態，故誤差較大[26]。

紅色熒光蛋白(DsRed)是從珊瑚蟲Discosomagenus中克隆的一種在紫外光的照射下可發射紅色熒光的蛋白，有許多突變體。通過研究發現DsRed-Express-2能在酵母細胞中高效表達，將其重組于酵母細胞作為內參比(為第二信號)，用以反映細胞的數量和狀態，通過分別測yEGFP和DsRed-Express-2發光強度，用yEGFP/DsRed-Express-2的比值即相對發光度消除細胞數量及狀態不同對yEGFP發光度的影響。該雙發光酵母細胞不需要添加任何化學反應試劑，可在96或384孔細胞培養內操作，故能方便、快速、定性、定量、高通量、自動化地篩選化學誘變物。

在所受試的化學誘變原中，有些可能是因分子量較大(如絲裂霉素C等)，不易進入細胞；有些可能是在細胞酶的作用下被滅活。這可能是呈現陰性結果的原因。

四環素是從放線菌金色鏈叢菌(Streptomyces aureofa-ciens)的培養液等分離出來的抗菌物質，是一種廣譜抗菌素，其作用機制是與核蛋白體的30S亞單位結合，從而阻止氨酰基-tRNA同核糖核蛋白體結合；刀豆氨酸的結構與精氨酸相似，可代替精氨酸合成蛋白質，由于刀豆氨酸與精氨酸結構的不同，所形成蛋白質的功能也會出現異常，最終導致細胞死亡；秋水仙素是一種生物堿，能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。以上這3種化學物均呈陰性結果，說明該細胞具有良好的特異性。

當化學誘變原作用機體細胞時，會通過各種DNA作用水平引起基因突變。化學物是否會引起機體細胞基因發生突變，與化學物性質、作用細胞DNA的途徑以及細胞的生物屬性等因素有關。因此，現行的化學物致突變評價方法，是通過各種不同方法或途徑篩選化學誘變原，其目的是減低化學物對人體發生基因突變的風險。與構建的RNR2調控的雙信號發光酵母細胞相比較[3]，雖然，RNR3調控的雙信號發光酵母細胞假陰性率較高，但提供了一種新的篩選誘變原的方法或路徑，如果作為傳統化學物致突變評價方法的補充，這無疑會進一步降低所評價化學物對人體基因致突變的風險。