大腦中動脈線栓法復制卒中后創傷后應激障礙樣大鼠模型的建立*

李龍梅，毛萌，鄧志云，宋慧榮，羅亞敏，李佳林，武佳杰，任小巧

(北京中醫藥大學，北京 100029)

腦卒中是一種具有高患病率、高發病率、高死亡率和高致殘率特點的“四高”疾病，是全球范圍內第二大常見死亡原因和第三大常見致殘原因[1]。腦卒中不僅造成了軀體上的殘障，而且對患者的精神、心理、社會參與能力也產生了不容忽視的影響[2]。此病屬于突發性、災難性疾病，患者多無思想準備，通常會給患者帶來較大的心理刺激，可被認為是嚴重的“腦創傷”事件。部分患者在腦卒中后除神經功能障礙癥狀外，還通常出現對腦卒中過程中情境的重復性體驗、情感麻木、回避、警覺性增高以及強烈煩躁不安和認知障礙等自主神經系統癥狀，即卒中后出現的創傷后應激障礙[3]。隨著腦卒中的高發，卒中后創傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)也不容忽視，此類患者如不能得到及時有效的治療，不僅軀體及認知功能的恢復會受到限制，而且存在病情惡化甚至死亡的風險。近年來國內對卒中后PTSD的關注度日益增高，但其實驗研究仍缺乏公認的動物模型，所以建立一種能有效模擬人類卒中后PTSD發生發展過程的動物模型對深入研究該病的病因、發病機制和治療等具有積極意義。本研究采用大腦中動脈線栓法制備大鼠腦卒中模型，探索其是否具有PTSD狀態并評價，為卒中后PTSD疾病模型的開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 成年健康雄性Wistar大鼠45只，體質量(220±10) g，SPF級，由斯貝福(北京)生物科技有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0002。實驗在北京中醫藥大學動物房中進行，室內溫度： 23～25 ℃，相對濕度：(55 ±10) %，40 W日光燈照射，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜。實驗前動物適應性飼養3 d，以全價顆粒飼料喂養，自由飲水。造模前將大鼠隨機分為3組，模型對照組、假手術組、單次延長應激(single-prolonged stress，SPS)組。實驗過程中對動物的處理均遵循動物實驗的3R原則。

1.2實驗試劑 75%乙醇購自安徽太和縣光明酒精分裝廠(批號：160606)；無水乙醚購自北京化工廠(批號： 20170417)。Trizol購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，Power SYBR green購自Invitrogen公司，引物由生工生物工程股份有限公司設計并合成。

1.3主要儀器 圓桶狀透明塑料大鼠固定器：長25 cm，外徑7 cm，內徑5 cm，由北京中醫藥大學方劑學教研室提供；水箱：底65 cm×100 cm、高80 cm 的立方形紅色塑料水箱；行為學觀察及自動分析系統：Nodule公司生產，包括計算機、攝像監控系統、Observior及Ethevision行為學分析軟件。

1.4造模

1.4.1采用腦中動脈線栓法復制局灶性腦缺血模型大鼠 參照LONGA等[4]報道的線栓法建立腦缺血大鼠模型。采用10%水合氯醛(400 g·kg-1)對模型對照組大鼠進行腹腔注射，麻醉后取仰臥位固定于手術臺上，消毒備皮，經頸正中切口后鈍性分離右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)及頸外動脈(external carotid artery，ECA)，結扎CCA和ECA，在CCA近分叉處剪一小口，經ECA向ICA插入線栓，阻斷大腦中動脈血供，缺血90 min后拔除線栓，成功制備大腦中動脈閉塞再灌注損傷模型。假手術組除不插入線栓外，其他處理同上。術后6 h，根據Longa的6點評分法對模型對照組大鼠進行神經癥狀學評分，1～4分的納入本研究。

1.4.2復制PTSD大鼠模型 對SPS組大鼠采用國際通用的單次延長應激方法建立PTSD模型[5]。處理步驟如下：緊密束縛2 h，隨后強迫游泳20 min(水深40 cm，水溫25 ℃)，經過15 min的自然恢復，密閉容器內乙醚麻醉至意識喪失，待其意識恢復后把動物放回鼠籠靜養。

1.5行為學檢測 于造模后第 7天及第14天兩個時點進行行為學測試，測試均在安靜環境中進行，開始前讓大鼠在測試間適應1 h。

1.5.1高架十字迷宮實驗 實驗裝置由兩條相對開放臂(50 cm×10 cm)和兩條相對閉合臂(50 cm×50 cm×10 cm)及中央區(10 cm×10 cm)連接而成，距離地面50 cm將大鼠從中央格面向閉合臂放入，釋放后開始觀察并記錄5 min內大鼠的活動情況。5 min后取出大鼠，用乙醇擦拭設備以清除大鼠殘留的大、小便及氣味等信息。統計以下數據：開放臂進入次數、開放臂進入時間、閉合臂進入次數、閉合臂進入時間，評判者由非實驗人員完成以保證結果客觀。進臂總次數=開放臂進入次數+閉合臂進入次數；開放臂進入次數比(%)= 開放臂進入次數/(開放臂進入次數+閉合臂進入次數)×100%；開放臂進入時間比(%)= 開放臂進入時間/(開放臂進入時間+閉合臂進入時間)×100%，同理計算閉合臂進入次數比與進入時間比。

1.5.2社交趨避實驗 社交趨避測試箱：敞口實驗箱(100 cm×100 cm×40 cm)，黑色內壁。黑箱1為側拉門實驗箱(25 cm×25 cm×25 cm)，黑色不透光。黑箱2(25 cm×25 cm×25 cm)的箱一側壁為鐵絲網格，可通過網格觀察到外界事物，其他側壁均為黑色不透光側壁。在實驗箱內的一側中間貼壁放入黑箱1，在其對面一側中間貼壁放入裝有社交目標大鼠的黑箱2，黑箱2的前、左、右三側20 cm區域定義為社交區域。測試開始前先將動物放入黑箱1中適應2 min，然后打開擋板，測試5 min，觀察并記錄大鼠走出黑箱1的潛伏期、社交區進入次數、社交區域進入時間、直立次數。測試后拿出動物，乙醇擦拭實驗箱和黑盒。

1.6熒光定量PCR 14 d行為學結束后，將大鼠麻醉后斷頭取腦，在冰盤上迅速分離右側海馬組織，置于潔凈的EP管中，置于液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱中備用。用Trizol試劑提取海馬組織的RNA，反轉錄。PCR反應體系為20 μL：SYBR green 10 μL、上游、下游引物(10 μm)各0.4 μL，cDNA為反轉錄原液(20 μg RNA)稀釋后2 μL、ddH2O 7.6 μL。引物序列(5'→3')：GAD67正義鏈AATACTACCAACCTGC-GTCCTACAAC，GAD67反義鏈：GACGACTCTTCTCTT-CCAGGCTATTG；GAD65正義鏈：TGCGAGTTCTGG-AAGACAATGAAGAG，GAD65反義鏈：ACCATGCGG-AAGAAGTTGACCTTATC；GLT1正義鏈：GGGTGCC-AACAATATGCCCA，GLT1反義鏈：GGTTCTTCCCC-AGCTTGTCG。PCR反應條件如下： 95 ℃，10 min，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s(讀取熒光數值)，共40個循環。熔解曲線： 擴增循環結束后，95 ℃，15 s，60 ℃(讀取熒光數值)，1 min，然后從60 ℃至95 ℃ ，每增加 0.3 ℃，讀取一次吸光值，最后95 ℃，15 s。PCR結果按2-△Ct，并進行統計學分析。

2 結果

2.1社交趨避實驗結果 與假手術組比較，模型對照組大鼠潛伏期明顯延長(χ2=22.50，P<0.01)、社交區進入時間明顯縮短(χ2=21.50，P<0.01)、站立次數明顯減少(χ2=17.20，P<0.01)；SPS組大鼠潛伏期延長(χ2=12.34，P<0.05)、社交區進入時間明顯縮短(χ2=18.07，P<0.01)、直立次數減少(χ2=13.18，P<0.05)。14 d時模型對照組與SPS組各指標變化趨勢同7 d，均差異有統計學意義(P<0.01)。模型對照組與SPS組比較，除了站立次數兩組差異明顯(P<0.01)外，其他各指標數據相近，7和14 d時均差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，2。

2.2高架十字迷宮結果 與假手術組比較，模型對照組大鼠開放壁進入次數比減少(χ2=9.68，P<0.05)、開放壁進入時間比減少(χ2=11.23，P<0.05)、進臂總次數差異不明顯(χ2=6.43，P>0.05)；SPS組大鼠開放壁進入次數比減少(χ2=10.24，P<0.05)、開放壁進入時間比減少(χ2=11.62，P<0.05)，進臂總次數差異不明顯(χ2=5.59，P>0.05)。7 d時，與假手術組比較，模型對照組與SPS組各指標差異無統計學意義，但變化趨勢同14 d。模型對照組與SPS組比較，7和14 d時各指標數據相近，均差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，4。

表1 3組大鼠7 d社交趨避實驗行為學指標比較

Tab.1Comparisonoftheparametersofsocialapproach-avoidancetestat7damongthreegroupsofrats

組別潛伏期社交區進入時間s社交區進入站立次假手術組151.66±14.6134.01±6.802.13±1.253.40±1.50模型對照組205.04±20.99?17.93±2.98?11.10±0.571.00±0.67?1SPS組177.43±15.96?29.87±2.73?11.36±0.631.79±0.97?1?3χ224.1427.5311.0223.79

與假手術組比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與模型對照組比較，*3P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01，*2P<0.05；compared with model control group，*3P<0.01

表2 3組大鼠14 d社交趨避實驗行為學指標比較

Tab.2Comparisonoftheparametersofsocialapproach-avoidancetestat14damongthreegroupsofrats

組別潛伏期社交區進入時間s社交區進入站立次假手術組95.51±8.7836.26±8.572.60±0.703.20±0.63模型對照組189.76±15.75?17.90±4.54?10.90±0.57?10.50±0.53?1SPS組173.53±14.93?112.50±6.05?11.11±0.66?11.32±1.53?1?2χ224.5724.1222.6727.85

與假手術組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01

表3 3組大鼠7 d高架十字迷宮實驗行為學指標比較

Tab.3Comparisonoftheparametersofelevatedplusmazetestat7damongthreegroupsofrats

組別開放臂進入次數比/%進入時間比/%進臂總次數/次假手術組0.36±0.150.11±0.118.14±5.46模型對照組0.18±0.23?10.03±0.05?13.42±2.71SPS組0.21±0.19?10.04±0.06?15.64±4.13χ22.944.8826.00

與假手術組比較，*1P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05

表4 3組大鼠14 d 高架十字迷宮實驗行為學指標比較

Tab.4Comparisonoftheparametersofelevatedplusmazetestat14damongthreegroupsofrats

組別開放臂進入次數比/%進入時間比/%進臂總次數/次假手術組0.55±0.230.14±0.875.56±2.07模型對照組0.29±0.22?10.04±0.03?13.60±1.84SPS組0.27±0.25?10.04±0.04?13.79±1.58χ27.269.3914.67

與假手術組比較，*1P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05

2.3熒光定量PCR結果 與假手術組比較，模型對照組大鼠內GAD67(χ2=13.93，P<0.05)、GAD65(χ2=21.93，P<0.01)、GLT1(χ2=8.58，P<0.05)的基因表達均減少；SPS組大鼠海馬內GAD65(χ2=20.93，P<0.01)、GLT1(χ2=19.75，P<0.01)，GAD67有減少趨勢。見表5。

表5 3組大鼠14 d海馬內目的基因mRNA表達情況比較

Tab.5ComparisonofthemRNAexpressionoftargetgenesinhippocampusat14damongthreegroupsofrats

組別GAD67GAD65GLT1假手術組1.03±0.271.04±0.291.08±0.36模型對照組0.68±0.25?10.60±0.13?20.79±0.24?1SPS組0.87±0.36?30.63±0.16?20.41±0.17?2?3χ28.923.4426.12

與假手術組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與模型對照組比較，*3P<0.05

Compared with sham operation group，*1P<0.05，*2P<0.01；compared with model control group，*3P<0.05

3 討論

腦卒中后個體的生理及心理受到了傷害，加之手術、社會關系改變易引發PTSD，有些患者會帶病多年且不能完全恢復[6-7]，造成了一定的醫療和社會負擔。目前尚無對PTSD的各組癥狀均能產生滿意療效的藥物，因此開展對卒中后PTSD的研究對于了解其發病機制和尋找干預措施具有重要意義。卒中后PTSD在國內尚未引起足夠的重視，鮮見對其模型探索的研究，而效度良好的動物模型是開展實驗研究的基礎，所以卒中后PTSD動物模型的建立迫在眉睫。PTSD-SPS模型是2005年在日本召開的“基礎和臨床的研究進展”會議中確定的，它通過束縛、強迫游泳和乙醚麻醉分別對動物的心理、生理及內分泌造成應激，可模擬PTSD患者的焦慮反應、高度警覺性以及神經內分泌改變，且所導致的焦慮、抑郁等可通過藥物改善，重復性好，成為目前國際公認的PTSD動物模型之一[8-10]。因其具有可靠的表觀、結構和預測效度，故可作為本研究中以大腦中動脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)造模是否出現PTSD狀態的良好對照。PTSD患者通常會出現認知及心境方面的消極改變，存在著情感麻木或回避現象，具體表現可有對陌生的人或事物興趣降低、與外界疏遠隔離、交流減少等，所以社會能力尤其是社交能力在PTSD動物模型的行為學評價中尤為重要[11]。社交趨避實驗是一種評價嚙齒類動物社交行為的有效方法，實驗中受試鼠對刺激鼠的接近或逃避行為能較好的反應大鼠的社交能力與抑郁狀態，通過受試鼠第一次走出黑箱的時間、走進刺激鼠所在社交區域的時間及次數等來描述動物的社會偏好行為[12]。本實驗中假手術組大鼠在較短時間內就從保護性黑箱中爬出來并進行探索，多次進入陌生同類所在區域并與其交流，而模型對照組和SPS大鼠與假手術組大鼠比較，第一次走出保護性黑箱的時間都延長，靠近社交區的時間和次數也都減少，且有較高的防御性，不愿與同類交流，可見模型對照組和SPS組大鼠對外界表現出一定的回避狀態，對陌生同類的興趣和交流欲望減少，提示這兩組大鼠的社交回避趨勢明顯。PTSD患者的恐懼、回避以及警覺性增高屬于人類的焦慮反應，可出現對創傷有關的刺激產生恐懼反應，甚至對無關的低刺激表現出高警覺狀態[13]。高架十字迷宮實驗是測試動物焦慮及回避癥狀的有效實驗方法，通過利用嚙齒類動物在選擇探索新異環境還是回避高懸開放臂時產生的矛盾行為來反應其焦慮狀態。本研究中高架十字迷宮實驗結果顯示，將模型對照組和SPS組大鼠至于中央區后，大鼠很快逃離到閉合臂中，很少去開放壁，且在開放壁的停留時間短暫；而假手術組大鼠對開放臂有較強的探究欲望，會在開放壁停留較多時間。此現象提示模型對照組和SPS組的大鼠探究天性和對外界的好奇心理減弱，焦慮反應較假手術組增強。7 d時SPS組大鼠的焦慮表現與假手術組差異不明顯，而在14 d時出現明顯差異，驗證了SEROVA等[14]發現的SPS可導致延遲性焦慮反應和警覺度增高的現象。

PTSD的發生與中樞神經系統中的興奮性神經遞質谷氨酸(glutamate，Glu)與抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的平衡失調密切相關，同時與負責空間學習記憶的重要腦區海馬的損傷有關。Glu與PTSD發生過程中記憶的形成關系緊密，創傷事件后Glu水平的升高可以導致創傷記憶的編碼和鞏固，且高含量的Glu也可導致海馬結構的損傷[15]。而GABA可以調節機體面對應激時的多種生理反應[16]，同時可以防止神經系統的過度激活及Glu的過度釋放[17]。在Glu與GABA的代謝過程中，Glu可被星形膠質細胞膜上的谷氨酸轉運體攝取到胞內而消除神經興奮毒性，也可經谷氨酸脫羧酶(GAD) 脫羧后生成能拮抗Glu神經興奮毒性的GABA。90%以上的谷氨酸是由谷氨酸轉運體1(GLT1)攝取和轉運的[18]，合成GABA的兩種同工酶(GAD65和GAD67)的分布與GABA能神經元的分布基本一致[19]，故通過測定GLT1和GAD的活性可推測Glu與GABA的含量變化。本實驗中，14 d后模型對照組與SPS大鼠海馬內GLT1 、GAD65和GAD67的基因表達均減少，表明海馬內星形膠質細胞攝取Glu的能力減弱且合成GABA的能力受到抑制，因此推測模型對照組與SPS組大鼠海馬內Glu含量增多而GABA含量減少。增多的Glu興奮毒性增加，且GABA的含量減少使其對神經系統的抑制作用及對Glu的拮抗減弱，更加劇了Glu與GABA的失衡狀態。研究顯示Glu與GABA的失衡狀態可能是PTSD中應激高喚醒癥狀產生與維持的重要原因[20]。這與本實驗中模型對照組大鼠出現高警覺狀態的表現相符。行為學實驗中模型對照組大鼠對陌生環境產生恐懼，回避同類，回避交流，對低危險的環境和事物保持高警覺，其表現與SPS造成的PTSD大鼠行為類似，同時與高杰等[21-22]先前對PTSD大鼠的研究結果相近。PCR實驗結果可推測各組大鼠行為學表現的差異可能與其海馬內Glu和GABA的含量變化有關，Glu增多、GABA減少的失衡狀態可導致大鼠焦慮反應增強、恐怖記憶加深從而出現回避和高警覺狀態等表現。由此可見，MCAO方法對大鼠造成了刺激并使其出現了應激反應，成功模擬了PTSD 狀態的恐懼反應、警覺性增高、逃避行為、環境適應能力下降等。

綜上所述，MCAO方法造成了一定程度的PTSD狀態，其在社交趨避和高架十字迷宮實驗中的行為學表現和海馬內Glu與GABA的失衡狀態與SPS造成的PTSD大鼠無明顯差異。成功的動物模型需要有良好的表面效度、結構效度和預測效度，對于卒中后PTSD的動物模型來說，MCAO方法模擬了腦卒中腦缺血-再灌注的過程，且造模后出現了與SPS大鼠類似的應激障礙，故可以認為MCAO方法作為卒中后PTSD的動物模型有一定的表面效度和結構效度。至于此模型的預測效度以及造成的PTSD狀態在神經生理學上是否與SPS大鼠也有一致性等問題還有待于后續的深入研究。