超聲輔助化香樹果序多糖提取工藝*

張麗華，趙鵬 ，張婷婷 ，杜永鵬

(1.陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712046； 2.咸陽市麗彩醫藥有限公司，咸陽 712046)

化香樹是胡桃科(StrobilaceaSieb.etZucc)植物，應用干燥果序入藥，具有清熱瀉火、消除腫痛等功效，可用于治療鼻炎等疾病[1]。多酚、黃酮、多糖等是化香樹果序的活性成分[2-4]。其中多糖含有良好的抗氧化性，但關于其提取、分離純化工藝研究很少。鑒于多糖又是中藥中基本上都含有的活性成分，并在免疫調節、腫瘤、衰老等方面能起到一定的藥理作用[5-7]。本實驗主要是控制單因素變量，利用超聲輔助對化香樹果序多糖的提取工藝進行了優化研究。中藥內許多有效成分均需要破壞細胞結構才能釋放出來，現有的科學方法很難達到實驗要求破除細胞的效果。超聲提取法可以通過三大效應分裂細胞，使得溶劑進入藥材或把藥材的化學成分擴散到細胞外，再通過分離純化的方法進行相關成分提取，從而可以提高破碎的效果。超聲提取的優點有提取時間短、提取率高、節省材料等，這些優點使其在中藥提取中得到了廣泛的應用[8-11]。

1 試劑與儀器

1.1試劑 化香樹果序、葡萄糖(AR)、濃硫酸(AR)、無水乙醇(95%)(AR)、苯酚(AR，天津科密歐化學試劑有限公司)，化香樹果序藥材購自西安萬壽路藥材市場，經藥學院趙鵬教授鑒定為化香樹屬植物化香樹的果序。

1.2儀器 EYELA旋轉蒸發儀-上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵-鞏義市予華儀器有限責任公司；VOSHIN-1500C低溫超聲波萃取儀-無錫沃信儀器制造公司；電子天平(梅特勒-托利多有限責任公司，感量：0.01 mg)。

2 方法與結果

2.1提取工藝流程 首先，把經干燥處理的化香樹果序用粉碎機粉碎，并過篩孔內徑0.250 mm篩。 其次，把粉末進行脫脂，使用無水乙醇(95%)進行處理。再次，把水和脫脂后的粉末進行混合，并用超聲輔助浸提3次進行過濾，將濾液按照生藥體積比1：1進行濃縮，然后加入無水乙醇進行沉淀。過夜，把溶液抽濾，再進行干燥，獲得化香樹果序粗多糖。見圖1。

2.2多糖含量與提取率 應用苯酚-硫酸法測定多糖含量[5]。準確稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25 mg，置于25 mL量瓶中，加純化水定容，得到1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液。準確吸取0，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL葡萄糖標準溶液分別置于具塞試管中，加水定容至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，再于沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫；以未加葡萄糖標準溶液的試管做空白對照，在波長490 nm下應用分光光度計測定樣品吸光度。以吸光度為縱坐標，多糖濃度為橫坐標，將上述數據進行線性回歸，可以得到的方程為：A=0.010 3C+0.000 4，相關系數r=0.999 1，濃度范圍是0～50 μg·mL-1，線性關系良好。多糖提取率的計算用下式：多糖提取率(%)=(提取物質量×多糖的含量/原料質量)×100% (1)

準確稱量實驗所得粗多糖干燥品10 mg，置于50 mL量瓶，用少量蒸餾水溶解后定容，準確移取多糖溶液0.2 mL，依據苯酚-硫酸法測得吸光度，代入直線方程算出粗多糖的百分含量，再由式(1)算出多糖的提取率。

圖1 粗多糖提取工藝示意圖

2.3統計學方法 響應面分析方法是一種優化實驗條件的設計方法，用于解決非線性數據處理的問題[12]。依據單因素實驗結果，Box-Behnken Design設計實驗，應用Design -Expert v7.1.3軟件，對實驗得到的數據，進行多元二次回歸方程數據擬合，繪制響應曲面和等高線圖，分析預測得到較優工藝參數。Design -Expert v7.1.3軟件是專業響應面分析軟件，能夠大大減少所需要的實驗次數，提高實驗效率。響應面法相對于正交實驗法，精密度高、預測值接近真實值，結果更加合理、可靠。

2.4單因素分析

2.4.1超聲時間對多糖提取率的影響 保持其他條件不變，用不同的超聲時間來觀察多糖提取率的變化，結果顯示，在超聲時間為40 min左右提取率的峰值最高之后趨于平緩，因此40 min是最佳提取的時間。見圖2。

2.4.2超聲功率對多糖提取率的影響 保持其他條件不變，用不同的超聲功率觀察多糖提取率的變化，結果顯示，在超聲功率250 W提取率為最高之后曲線下降，因此250 W是提取的最佳超聲功率。見圖3。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響

Fig.2Effectsofultraphonictimeonextractionratioofpolysaccharides

圖3 功率對多糖提取率的影響

Fig.3Effectsofpoweronextractionratioofpolysaccharides

2.4.3溫度對多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變提取溫度來觀察多糖提取率，結果顯示，在提取溫度是50 ℃時，提取率曲線達到最高點之后下降。 因此50 ℃是提取的最佳溫度。見圖4。

2.4.4液料比對多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變液料比觀察多糖提取率的變化，結果顯示，當液料比為25(mL·g-1)時，多糖提取率前上升且趨于平緩，因此25(mL·g-1)為最合適的料液比。見圖5。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響

Fig.4Effectsoftemperatureonextractionratioofpolysaccharides

圖5 液料比對多糖提取率的影響

Fig.5Effectsoftheratioofwatertomaterialonextractionratioofpolysaccharides

2.4.5提取次數對多糖提取率的影響 保持其他條件不變，改變提取次數來觀察多糖提取率的變化，結果表明，在經過3次提取時多糖的提取率變化幅度逐漸平緩，所以3次是最佳的提取次數。見圖6。

圖6 提取次數對多糖提取率的影響

Fig.6Effectsoftimesonextractionratioofpolysaccharides

2.5響應面法優化超聲工藝

2.5.1響應值結果及其擬合模型 本實驗根據組合試驗設計原理，討論單因素條件下的的實驗結果，得出在3次提取次數，25(mL·g-1)的液料比下，選取時間、超聲功率和溫度這3個因素對化香樹果序多糖提取率影響顯著，因此需要進行優化實驗分析[12]。結果顯示，通過Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的模型顯著水平遠遠小于0.05(P=0.001 3)，說明該模型是基本正確的。從失擬性檢驗結果來看，失擬誤差很小(P=0.4336)，說明實驗中的未知因素對于實驗結果影響很小，預測的回歸模型與實際實驗結果結合得較好。而且預測模型的R2=0.977 9，說明提取率的實驗值與其預測值之間相一致，該模型的變異系數CV=1.45%(<5%)，校正系數R2Adj= 0.938 0這說明預測的模型能反映93.80%響應值的變化，因此通過回歸方程能夠預測真實的數據，并對真實的實驗數據進行分析。在對各個單因素分析中，超聲功率對化香樹果序多糖提取率影響最大，其次是提取溫度，超聲時間影響程度最小，但超聲時間與提取溫度之間的相互影響最明顯。根據Design-Expert v7.1.3軟件擬合得到的回歸方程為：

Y=3.82-0.023X1+0.16X2+0.054X3+0.032X1X2+0.16X1X3-0.032X2X3-0.20X12-0.1X22-0.16X32(2)

見表1-3。

表1 響應面分析因素與水平

Tab.1Factorsandlevelsofresponsesurfaceanalysis

水平超聲時間X1(A)/min超聲功率X2(B)/W溫度X3(C)/ ℃-135200400402505014530060

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

A=(X1-40)/5，B=(X2-250)/50，C=(X3-50)/10

2.5.2等高線圖和響應面圖分析 結果顯示，超聲功率總體趨勢比較陡峭，即影響是最明顯的；而溫度的總體趨勢較為平緩，即影響較??； 提取時間的影響最小。得到回歸模型方程一階數據：X1= 0.05，X2=0.65，X3=0.2；所以預測最佳的工藝提取條件為：超聲時間為40.25 min，超聲功率是282.5 W，提取溫度52 ℃，多糖提取率是3.973%。見圖7-9。

2.5.3驗證比較實驗 根據實際實驗操作的情況，將提取工藝條件調整為：超聲時間40 min，超聲功率290 W，提取溫度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，3次提取；并在這樣的條件下進行3次實驗重復驗證，多糖平均提取率為3.959%，和預測的提取率的結果相一致，這表示應用響應面法優化分析的結果符合實驗的要求；而與傳統水提法比較，超聲法所用提取時間明顯縮短，提取率較高。

表2 Box-Behnken設計方案及響應值

Tab.2ProgramandresponsevalueofBox-Behnken

實驗序號ABC提取率/%10-113.48620-1-13.339310-13.18241-103.31851103.72860113.7077-10-13.6028-1103.665901-13.68610-1-103.371110003.801121013.633130003.875140003.79115-1013.413

表3 方差分析

* Pr>F值小于0.05為顯著；** Pr>F值小于0.0001為高度顯著

* Pr>F value less than 0.05 is significant; ** Pr>F value less than 0.0001 is highly significant

圖7 時間與功率對多糖提取率的影響

Fig.7Effectoftimeandpoweronextractionratioofpolysaccharides

圖8 溫度與時間對多糖提取率的影響

Fig.8Effectoftemperatureandtimeonextractionratioofpolysaccharidesofpolysaccharides

圖9 溫度與功率對多糖提取率的影響

Fig.9Effectoftemperatureandpoweronextractionratioofpolysaccharides

3 討論

本次實驗采取了超聲輔助化香樹果序多糖提取的最佳工藝進行了優化研究，最終得到了和數學模型相符合的實驗結果和化香樹果序多糖提取最佳工藝條件，即為：超聲時間40 min，超聲功率290 W，提取溫度52 ℃，液料比25(mL·g-1)，提取次數3次，化香樹果序多糖的平均提取率可以達到3.959%。本次實驗主要研究超聲輔助化香樹果序多糖提取最佳工藝條件，研究結果可為化香樹果序多糖進一步深入研究及同類研究等提供參考。