Box-Behnken法優化大葉櫸樹黃酮類超聲輔助提取方法及初步鑒定

劉曉玲，金曉玲,2，張旻桓，張亞平,3，曾 艷，柴弋霞

（1.中南林業科技大學風景園林學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省環境資源植物開發與利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410000；3.貴州農業職業學院，貴州 貴陽 551400）

大葉櫸樹Zelkova schneideriana秋葉顏色豐富，五彩繽紛，是營造園林秋景的鄉土樹種[1]。對大葉櫸樹秋季葉色成色原理的研究，主要集中在葉綠素、類胡蘿卜素和花青苷的含量和變化規律上，少有涉及除花青苷外的其他黃酮類物質[2-3]。但黃酮類作為植物體內重要的次生代謝物質，在植物葉片成色上起著重要作用。如‘北陸’Vaccinium corymbosum×V.angustifolium葉片變紅與黃酮醇含量顯著相關；蘆丁等單體酚是三葉海棠Malus sieboldii葉片成色的主要輔色素[4-5]。這些研究表明，除花青苷外，大葉櫸樹葉片成色或還與其余的黃酮類物質密切相關。

然而，要對大葉櫸樹黃酮類深入研究，必須獲得其提取方法。現有研究中，Box-Behnken法具有可減少實驗組數、縮短試驗周期、能求得高精度回歸模型、還能通過響應面圖反映因素之間的交互作用等優點，被認為比傳統的單因素和正交試驗設計更精準可靠[6-7]，已在串葉松香草Silphium perfolialum，黃秋葵Abelmoschu sesculentus，落花生Arachishy pogaea以及艾Artemisia argyi等植物的黃酮類物質提取中得到了很好的應用[8-11]。

因此通過Box-Behnken實驗設計，篩選大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最優條件，并通過顯色反應初步確定大葉櫸樹葉片中的黃酮類物質的種類，為之后進一步研究大葉櫸樹葉片黃酮類與成色之間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年8月26日，在湖南長沙南方林業生態應用技術國家工程實驗室溫室，隨機采摘27株1年生大葉櫸樹嫁接苗，取每株中部成熟葉片1～3片。

1.2 實驗方法

1.2.1 大葉櫸樹葉片黃酮類提取流程 提取的基本流程：大葉櫸樹葉片→去除葉中脈與鋸齒→液氮研磨→-20℃凍干粉末→超聲波（180 W，40 KHz）下乙醇提取→10 000 r·min-1離心（TGL-20M臺式高速冷凍離心機）→上清液→測定黃酮類提取量。

1.2.2 黃酮類提取量的測定方法 采用鋁鹽顯色法[12]，橫坐標為槲皮素標準溶液的質量濃度，縱坐標為測定的吸光度值，獲得標準曲線Y=1.098 4X+0.020 6（R2=0.996 1）。根據標準曲線計算大葉櫸樹葉片提取液黃酮類濃度后，提取量根據如下計算公式求得：

式中，P表示黃酮類提取量（mg·g-1）；c表示提取液黃酮類濃度（mg·mL-1）；V表示提取液體積（mL）；m表示凍干粉末質量（g）。

1.2.3 大葉櫸樹葉片黃酮類提取的單因素試驗 以黃酮類提取量為因變量，超聲波功率固定為180 W，頻率為40 KHz，乙醇濃度、液料比、超聲時間3個因素分別以60%，20:1mL·g-1，2 h為基礎，依次改變其中1個因素進行大葉櫸樹葉片黃酮類提取試驗（試驗平行數為3，下同）。每個因素設置7個水平梯度：乙醇濃度范圍30%～90%，梯度間隔10%；液料比范圍5:1～35:1mL·g-1，梯度間隔5:1；超聲時間范圍0.5～3.5 h，梯度間隔0.5 h。分析不同梯度對大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響。按照1.2.1的方法獲得大葉櫸樹葉片黃酮類提取液，根據1.2.2的方法計算黃酮類提取量。

1.2.4 Box-Behnken實驗設計 根據單因素實驗結果，每個因素優選出3個水平，乙醇濃度（A）為：50%，60%，70%；液料比（B）為：25:1，30:1，35:1mL·g-1；超聲時間（C）為：1.0，1.5，2.0 h，以大葉櫸樹葉片黃酮類提取量為響應值，設計3因素3水平Box-Behnken的中心組合方案（表1）。

1.2.5 大葉櫸樹葉片黃酮類物質的初步鑒定 根據Box-Behnken的最佳提取方案獲得提取液，通過顯色反應對黃酮類物質進行初步鑒定，試驗方法參照參考文獻13。

1.3 數據分析

數據分析采用Excel 2007，SPSS 19和Design-Expert.V8.0.6，作圖采用Origin 8.5。

2 結果與分析

2.1 單個因素對黃酮類物質提取量的影響

2.1.1 乙醇濃度對黃酮類提取量的影響 乙醇濃度對大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響顯著（P＜0.05，下同）（圖1）。隨著乙醇濃度的升高，黃酮類提取量呈先增大后減少的趨勢，當乙醇濃度為60%時，提取量最大30.39mg·g-1，而在60%～90%時顯著減少。根據實驗，選取60%乙醇作為大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最佳濃度值。

2.1.2 液料比對黃酮類提取量的影響 從圖1可知，液料比對大葉櫸樹葉片黃酮類提取量有顯著的影響。隨著液料比增大，黃酮類提取量呈現先增大后減少的趨勢，當液料比為 30:1mL·g-1時，提取量最大 29.75mg·g-1。

2.1.3 提取時間對黃酮類提取量的影響 提取時間與大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的相互關系見圖1。隨著提取時間的增加，大葉櫸樹葉片中黃酮類的提取量先增大而后減少，在1.5 h時，提取量最大24.09mg·g-1。超過1.5 h后，提取量反而下降，因此選擇1.5 h為超聲處理最佳時間。

圖1 乙醇濃度、液料比、提取時間對大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響Figure1 Effect of ethanol concentration,liquid ratio and extracting time on flavonoid yield from Z.schneideriana leaves

2.2 Box-Behnken設計對提取方法的優化

2.2.1 大葉櫸樹葉片黃酮類提取的回歸模型 以單因素實驗結果為基礎，采用Box-Behnken設計原理，對A（50%，60%，70%），B（25:1，30:1，35:1）mL·g-1，C（1.0，1.5，2.0 h）這3個因素及對應的水平，進行響應面實驗設計，實驗設計方案與結果見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計及效應值Table1 Box-Behnken design and effect

根據軟件對試驗結果進行分析，得到大葉櫸樹葉片黃酮類提取的回歸模型為：

y=30.54+1.48A+1.39B+2.22C-0.54AB-0.25AC-0.26BC-2.36A2-3.50B2-2.19C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 對Box-Behnken實驗結果進行方差分析，結果見表2。

由表2可知，該回歸模型差異顯著（P＜0.05），相關系數R2=0.921 9。表明92.19%的實驗數據可以用該模型進行解釋，證明預測值與實驗值有較高的相關性。失擬項P值0.217 2＞0.05，差異不顯著，說明實驗誤差小。因此，該模型對于大葉櫸樹葉片黃酮類提取量實際值與預測值之間具有較好的擬合度。

表2 實驗結果方差分析Figure2 ANOVA on experiment result

2.2.3 Box-Behnken的優化結果 圖2a為提取大葉櫸樹葉片黃酮類物質的乙醇濃度與液料比響應面圖，圖2b為乙醇濃度與提取時間響應面圖，圖2c為液料比與提取時間的響應面圖。響應面圖開口向下，表明各因素作用增大時，響應面值增大，達到最高點后，各因素作用增大，響應面值減小。由圖2可以得出，3個因素兩兩之間形成的響應面圖開口均向下，說明其對提取率的影響都是先增大后減少。

圖2 各因素之間響應面圖Figure2 The response surface between various factors

圖3a為提取大葉櫸樹葉片黃酮類物質的乙醇濃度與液料比等值線圖，圖3b為乙醇濃度與提取時間等值線圖，圖3c為液料比與提取時間的等值線圖。等值線圖從圓到扁的變化，表示兩個因子之間相互關系從弱到強程度，越扁表示兩因素交互影響越強。由圖3中等值線形狀可見，兩兩因素之間的交互作用對大葉櫸樹黃酮類提取量的影響次序是：乙醇濃度與液料比＞乙醇濃度與提取時間＞液料比與提取時間。

2.2.4 最佳提取方法的確定及驗證實驗 根據二次線性回歸模型得出，大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最優條件為：乙醇濃度62.7%，液料比30.8:1mL·g-1，提取時間1.74 h，黃酮類的預測提取量為31.383 mL·g-1，但考慮實際可操作性，確定大葉櫸樹葉片黃酮類的提取方法為：乙醇濃度63%，液料比31:1mL·g-1，提取時間1.7 h，根據此條件，設置平行數為6的重復試驗，得到大葉櫸樹葉片黃酮類的提取量平均值為（31.067±0.11)mL·g-1，與模型所預測的基本一致，說明模型能較好預測實際值。

圖3 各因素之間等值線圖Figure3 The contour between the factors

2.3 大葉櫸樹葉片黃酮類物質提取液的初步鑒定

用簡單的顯色反應可以初步鑒定大葉櫸樹葉片提取物中黃酮類物質的存在，參照對野生百合Lilium brownievar.viridulum顯色反應對應的結果分析[13]，大葉櫸樹葉片提取液通過濃鹽酸-鋅粉反應，溶液呈現紫紅色，說明大葉櫸樹葉片中可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物；大葉櫸樹提取液與三氯化鋁反應，呈現淡黃色，表明存在黃酮；與醋酸鉛反應，出現黃色沉淀，說明具有鄰二酚羥基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物，大葉櫸樹黃酮類提取液中不含查耳酮和橙酮；與氨性氯化鍶反應產生黃棕沉淀，意味著色素分子中有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物。與硼酸反應，顏色變化不明顯，說明大葉櫸樹葉片含有少量或不含5’-羥基黃酮及2’-羥基査爾酮。

3 結論與討論

優化后大葉櫸樹黃酮類提取方法為：乙醇濃度63%，液料比31:1mL·g-1，提取時間1.7 h，提取量為（31.067±0.11)mL·g-1；3個因素中，乙醇濃度與液料比之間的交互作用最強。通過對大葉櫸樹葉片黃酮類提取液的顯色鑒定，其成分含有黃酮、具有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物以及具有鄰二苯酚羥基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物；可能有黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等；不含查爾酮和橙酮。

為了更有效的提取植物組織中的黃酮類物質，可采取多種措施。如物理方式：超聲波、微波等[14-15]；生物方式：添加果膠酶、纖維素酶等[16-18]，可以加速物質運動或破壞植物細胞結構，使黃酮類物質更好的溶于提取液中。已有研究表明，使用微波輔助，能更有效提取辣木Moringaoleifera葉中黃酮類[19]；在提取香椿Toonasinensis老葉中的黃酮類時，纖維素酶的添加可提高提取量[20]。在本實驗預實驗階段發現，超聲波作用0.5 h，大葉櫸樹黃酮類提取量顯著高于常溫浸提24 h，說明采用超聲波輔助提取大葉櫸樹黃酮類物質，是理想的措施。

在實驗的3個因素中，對于大葉櫸樹黃酮類提取量，乙醇濃度與液料比之間的交互影響最大。可能不同濃度乙醇的極性不同，在乙醇溶液極性與大葉櫸樹黃酮類最接近時，黃酮類溶解度大，獲得的提取量高，當乙醇濃度增大時，大葉櫸樹葉片黃酮類提取量下降，這除提取液極性減小，相溶性減弱外，葉片中質體色素、非黃酮類醇溶性物質等也會析出溶于溶液，影響黃酮類的提取；而在液料比比值較高時，大葉櫸樹葉片材料中黃酮類少，溶劑量多，同樣非黃酮類的醇溶性物質會溶出，使提取量降低[21]。兩個因素在導致提取量降低上有共同成因，所以在大葉櫸樹葉片黃酮類提取中，這兩者交互作用最強。

黃酮類物質多達幾千種[22]，確定植物葉片中具體存在的黃酮類物質種類有一定困難。目前，有關大葉櫸樹葉片黃酮類具體種類的報道鮮見，若直接采用高效液相色譜（HPLC）和色-質聯用（LC-MS）等方法，在標準品的選擇、時間程序的確立上，耗時久，費用高[23]。通過本研究中系列顯色反應，高效便捷的篩選出大葉櫸樹葉片中含有黃酮和具有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物，并可排除查爾酮和橙酮，既縮短了時間，又節省了經費，也為后期深入研究其中具體物質指明了方向。