古槐樹葉片主要性狀多樣性分析

楚曉曉，楊 勇，李雙云，夏 陽，周繼磊，劉盛芳，屈 星，龐彩紅

（1.山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點實驗室，山東 濟南 250014；3.甘肅農業大學園藝學院，甘肅 蘭州 730000；4.平涼職業技術學院，甘肅 平涼 744000；5.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟南 250014）

槐Sophora japonica為豆科Leguminosae槐屬Sophora落葉喬木樹種。原產中國，現南北各省區廣泛栽培，華北和黃土高原尤為多見，對土壤要求不嚴，適應能力強，在石灰性、酸性及輕鹽堿土上，甚至在山區水少的地方均可正常生長。此外槐冠大蔭濃，具有抗污染，耐煙塵，抗風等特點，是良好的遮蔭樹和行道樹，槐的花、枝、果實均可入藥，具有良好的開發利用前景[1-2]。

山東省古槐樹的數量居所有古樹名木之首[3]，絕對數量多，古樹樹齡長（300～1 800a），分布范圍較廣，加之當時的交通不發達，使古槐樹的基因型多樣性成為可能。另外，古樹歷經數百年乃至千年自然環境的考驗存活下來，表明其對逆境具有良好的抵抗能力，因此開展古槐樹種質資源的調查、收集、多樣性分析具有重要的現實意義，也為開展槐逆境脅迫適應機制、高抗種質材料早期診斷評價與優選技術研究提供材料，為槐雜交育種和分子育種奠定基礎，為新品種的選育提供種質背景。

近年來對槐研究多集中在催芽[4]、扦插[5-6]、嫁接[7-8]，組培[9]等方面，對葉表型多樣性分析還未見報道。葉片是高等植物進行光合、呼吸及蒸騰作用的主要器官，而葉外部形態特征與該植物的生理營養及其所在的生態地理因子有關[10]，其表型的變化將直接影響植物體的一切生理活動，因此葉表型性狀多樣性是遺傳物質多樣性的具體表現，是進行遺傳多樣性研究最基本、最重要的組成部分之一[11]。本試驗對72份古槐樹種質葉表型性狀遺傳多樣性進行分析研究，為槐的種質資源收集保存、鑒定分類、良種選育、栽培研究及開發利用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

72份古槐樹種質（樹齡均大于300年），來源于臨沂（LY）、煙臺（YT）、棗莊（ZZ）、淄博（ZB）四個地級市的不同縣、市、區，每個地級市18個無性系，2011年春天收集古樹上長勢好，無蟲無病的枝條，于當年四月底五月初進行嫁接，選取帶有2～3個飽滿芽的接穗，嫁接于1年生的實生苗砧木上，每個無性系嫁接10株，嫁接成活植株定植于山東文峰集團（威海市）苗圃（121°98′E，37°31′N），2012年定植。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集2016年8月，每份種質選取正常生長的植株3株，每株外圍取4個成熟枝（不同方向），從成熟枝條中部選取發育正常的一枝復葉，共計12個復葉，用于小葉數的統計和葉軸長的測定；選取復葉上（從頂葉數）第三對小葉，每份種質共計24片葉片用于小葉葉片性狀的觀察與數據的測定。

1.2.2 測定性狀小葉葉片的干質量（X1）、鮮質量（X2）、葉脈角（X3）、葉周長（X4）、葉面積（X5）、葉厚（X7）、葉長（X8）、葉寬（X9）、葉形指數（X10）、小葉數（X11）共10項，此外還有復葉葉軸長（X6），共計11個性狀。

1.2.3 測量方法葉厚測定 用游標卡尺測量葉片厚度，6片一組（24片葉片隨機分成4組，每組6片），測量后取平均值（精確到0.01mm）[12]；鮮質量測定：樣品采集后立即用METTLER TOLEDO（JE703CE）電子天平稱其鮮質量（精確到0.01g）；干質量測定：將葉片置于烘箱中烘至恒質量，METTLER TOLEDO（JE703CE）電子天平稱其干質量（精確到0.01g）；葉軸長測定：利用直尺測量葉軸的長度（精確到0.01 cm）；小葉數測定：通過目測進行觀測（片）；葉形指數測定：是葉長與葉寬的比值[13]。葉長、葉寬、葉周長、葉面積、葉脈角測定：利用EPSON V370掃描儀，獲取圖像，將待測葉片平鋪到掃描儀面板上，蓋上玻璃蓋板，使葉片完全平整展開，葉正面朝下；圖像類型為48位全彩，分辨率為300 dpi，文稿大小寬度215.9 mm，高度297.2 mm，圖像格式為bmp格式[14]。Digmizer4.2圖像分析軟件對掃描圖像進行分析，以圖片高度297.2 mm設置比例尺，測量葉面積（0.01 cm2）、葉周長、葉長、葉寬精確到（0.01 cm）；葉脈角利用軟件上的角度測量其葉脈角。

1.3 數據分析

利用Excel對原始數據的平均值、最大值、最小值、標準差、變異系數等進行整理統計；用SPASS軟件進行方差分析、主成成分分析、相關性分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 古槐樹葉片性狀的多樣性

數量性狀可用來分析遺傳變異的水平[15]，一般認為變異系數大于10%就說明樣本間的差異較大，變異系數越大，個體之間的差異也就越大，越有利于對種質資源進行鑒定、評價和利用[14]。對72份古槐樹葉片的11個性狀指標進行了統計分析，結果如表1。由表1可知，古槐樹葉片的干質量、鮮質量、葉脈角、葉周長、葉面積、葉軸長、葉厚、葉長、葉寬、葉形指數、小葉數的平均值分別為0.10 g，0.28 g，53.15°，16.40 cm，10.95 cm2，15.31 cm，0.28 mm，6.06 cm，2.49 cm，2.47，14片。變異系數11.88%～39.10%，平均變異系數23.26%。在所測種質葉片性狀中，鮮質量最大為0.77 g，最小為0.05 g，變異范圍最大，變異系數高達39.10%；葉厚的變異系數最低，11.88%，古槐樹的葉片性狀變異系數從小到大依次為：葉厚＜葉脈角＜葉形指數＜葉軸長＜小葉數＜葉寬＜葉長＜葉周長＜葉面積＜葉干質量＜葉鮮質量。經過F值檢驗，11個葉片性狀均達到了極顯著差異（P＜0.01），表明古槐樹葉片表型數量性狀變異范圍較大，差異顯著，遺傳變異水平較高，遺傳多樣性較豐富[16-17]。

表1 古槐樹葉表型性狀變異分析Table1 Analysisonphenotypic trait variation of old S.japonicaleaves

2.2 古槐樹葉片不同性狀間的相關性

相關性分析是指對兩個或多個具備相關性的變量元素進行分析，衡量兩個變量因素的相關密切程度。對72份古槐樹種質葉片性狀進行相關性分析，結果如表2。

表2 葉片不同性狀間的相關性分析Table2 Correlation analysis ondifferent leaf traits

由表2可知，葉面積與干質量、鮮質量、葉周長的相關系數達到了顯著性正相關，其相關系數分別為0.63，0.83，0.68。葉寬與干質量、鮮質量、葉脈角、葉周長、葉面積、葉長達到了極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）正相關，其相關系數分別為0.56，0.72，0.10，0.58，0.88，0.61。葉長與干質量、鮮質量、葉周長、葉面積存在顯著或極顯著正相關，其相關系數為0.51，0.67，0.83，0.77，葉周長與小葉數、鮮質量呈極顯著正相關，相關系數為0.43，0.58。葉形指數與葉周長、葉長之間存在極顯著正相關，其相關系數為0.30，0.48。小葉數與葉軸長之間的相關和干質量與鮮質量之間的相關存在極顯著正相關，其相關系數分別為0.63和0.60。另外，葉寬與葉面積相關系數達到極顯著，其相關系數最高0.88。結果顯示，不同性狀間存在一定的相關性，相關系數表明基于一個性狀的選擇也可能同時改良另一個性狀[18]，因此，在篩選與葉面積和葉周長相關的品種時，可以參考葉長和葉寬指標。在對多個葉片性狀進行改良時，應關注性狀間的相關性并充分利用這些相關性來提高育種效率。

2.3 古槐樹葉片性狀的主成分分析

通過主成分分析將11個性狀進行線性組合，構成少數不相關的新變量，原變量中的信息被新變量代替。將原始數據矩陣經過標準化后，進行主成分分析，通過分析，能更清楚地顯示各性狀在葉片表型性狀多樣性構成中的作用。

通過分析提取了4個主成分（表3），其累計貢獻率達到75.70%，包含了11個指標的大部分信息，因此選取前4個主成分作為槐葉片性狀選擇的綜合指標。在第1主成分中葉面積（PC1）占最高系數，方差貢獻率為37.85%，說明第1主成分是表示葉面積性狀的綜合因子；在第2主成分中葉軸長（PC2）占有最高系數，方差貢獻率為15%，說明第2主成分是表示葉軸長性狀的綜合因子；在第3主成分中葉形指數（PC3）占有最高系數，方差貢獻率為12.97%，說明第3主成分是表示葉形指數性狀的綜合因子；在第4主成分干重（PC4）占有最高系數，方差貢獻率為9.71%，說明第4主成分是表示干重的綜合因子。由此可知，槐葉片之間的差異主要表現為葉面積、葉軸長、葉形指數、干重的不同。這些主成分在槐種質分類上起到了重要作用，這些為槐新品種的選育過程中確定育種目標，提供了依據。

表3 葉片性狀主成分分析Table3 Principal componentanalysisonleaf phenotypic traits

2.4 古槐樹綜合性狀的聚類分析

對72份古槐樹種質葉表型的11個性狀的原始數據進行標準化，并計算歐式距離，利用可變類平均連接法（組間）對其進行聚類分析，將72份種質完全區分開，說明葉片性狀能夠反映各樣品間的差異（圖1），來自同一種源的種質沒有完全聚到一起，而是相互交叉。

由圖1表明，取閾值在22.5時，可分為3大類群，分別以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ命名（表4）。三大類群中，第Ⅰ類群包含2份種質，約占總樣本數的2.8%，與其它兩類群相比較，葉周長、葉長的平均值最大，分別為21.09 cm，6.62 cm。第Ⅱ類群包含4份種質，約占總樣本數的5.6%，與其它兩類群相比較，葉軸長、葉寬、葉形指數、小葉數的平均值最大，為18.6 cm，2.82 cm，2.87，13片。其余66份材料的為第Ⅲ類群，約占總樣本數的91.6%，鮮質量、干質量、葉脈角、葉面積的平均值最大，分別為0.29 g，0.10 g，53.59°，11.09 cm2。由此可見，72份古槐樹種質資源具有各自的葉片表型特征。

圖1 葉片主要性狀聚類圖Figure1 Dendrogram of leaf traits of S.japonica

表4 各類群的平均值Table4 Mean phenotypic traits of different groups

3 結論與討論

種質資源遺傳多樣性的研究能夠為親本選擇、雜交組合配制以及遺傳改良提供有效的信息。形態學方法是植物遺傳多樣性研究最直接、基礎的方法，表型多樣性是在形態水平上對遺傳多樣性進行的闡述[10,17,19-20]，很多學者先后利用表型性狀對種質資源的多樣性進行了分析[21-24]。如萬繼峰等[25]利用了12個葉片表型性狀進行了橄欖Canarium album種質表型多樣性研究，葉片表型變異系數為9.52%～25.09% ；徐斌等[18]利用14個葉片表型性狀對杜鵑紅山茶Camellia azalea的多樣性進行分析，葉片表型變異系數為5.30%～47.00%，變異系數差值比較大。本次研究了72份古槐樹種質11個葉片表型性狀的多樣性，其變異系數為11.88%～39.10%，且在0.01水平上達到了極顯著差異，結果說明葉片存在著豐富的多樣性，不同植物葉片的變異程度大小不同。宋偉栓[26]利用SRAP標記分析了32份不同來源地的古槐樹遺傳距離和相似系數，遺傳距離在0.104 0～0.916 3之間，平均值為0.397 9，遺傳相似系數變化范圍為0.333 3～0.888 9，平均值為0.619 0，說明古槐樹間存在一定程度的遺傳變異，但遺傳變異程度不是很大，這與葉片表型變異程度不太一致，可能與樣本量有一定關系，也可能是外部環境對表型的影響造成的。

基于表型性狀對古槐樹種質資源進行聚類分析，在歐式距離為22.5時，72份槐種質資源分為3大類群，發現同一地理種源的材料并未聚到一起，這與宋偉栓[26]的研究結果是一致的，說明聚類結果與各種源的地理位置分布不相符，即葉片性狀與種源無直接關系，出現這一結果的原因可能與氣候、土壤、海拔、以及引種等因子對表型的影響有關，有待進行進一步研究。

古槐樹的數量居山東省所有古樹名木之首，存在時間長，分布范圍較廣，基因型眾多，是具有創新利用潛力的種質資源，由于古槐樹特定的文化底蘊使得大量的古樹資源被保存下來，擴大了種質基因庫；另一方面對古槐樹表型性狀多樣性的分析，揭示了各個性狀之間的相關性，明確了各成分的貢獻率，為古槐樹表型新品種篩選與培育提供了參考，對于單株顯著特異性的，可進一步研究挖掘，探尋潛在開發利用價值，同時，根據育種目標選擇性狀互補的親本雜交組合，加速槐遺傳育種工作進程，為種質資源的保護、利用和創新提供物質基礎，也為古槐樹保護重點的劃定提供參考。