長鏈非編碼RNA Beta2.7通過上調eNOS/NO通路影響內皮細胞功能

葉 楠 龔 輝 王 昕

(復旦大學附屬金山醫院心內科 上海 201508)

心血管疾病是目前世界范圍內威脅人類健康、導致人類死亡的第一大疾病,嚴重影響我國居民健康[1-2]。血管內皮損傷與功能障礙是心血管事件鏈上最重要的病理機制,與高血壓、冠心病等嚴重危害人類健康的心血管疾病的發生發展及其危險因素互為因果,彼此促進[3]。血管內皮能夠合成、釋放多種生物活性物質,其中一氧化氮(nitric oxide,NO)由左旋精氨酸在內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的催化下合成,具有舒張血管、保護血管內皮、抗炎抗氧化及阻止血栓形成等作用[4]。eNOS是一氧化氮合酶同工酶中的一種亞型,在血管內皮細胞中特異性表達,其生物學活性在被磷酸化后顯著增強,從而促進內皮細胞產生并釋放NO[5]。eNOS/NO信號通路在調節和維持血管內皮功能方面發揮重要的作用,eNOS活性降低和NO生成減少均可引起血管內皮功能障礙[6-7]。

非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)是指不編碼蛋白質的RNA,包括rRNA、tRNA、snRNA、microRNA 等多種已知功能和未知功能的RNA。眾所周知,人類基因組中可轉錄的部分超過90%,但其中僅有不足2%的部分編碼為蛋白質[8-10]。通常認為,ncRNA不翻譯為蛋白質,在RNA 水平即能行使其生物學功能。其中,長度超過200個堿基的ncRNA分子占大多數,被稱為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA);它能夠和DNA、RNA或蛋白質結合,在多個層面實現對基因表達的調控[11]。LncRNA廣泛參與機體的生理和病理過程,與各心血管疾病的發生發展密切相關[12-13]。近年來,多項研究報道揭示了LncRNA與心血管疾病發生發展之間的聯系[14-15]。我們歸納了其中可能與血管內皮損傷相關的LncRNA,概況見表1。

表1 相關LncRNA的生物學功能及其病理意義Tab 1 Biological function and pathological significance of related LncRNA

EC:Endothelial cells;I/R:Ischemia/reperfusion;VSMC:Vascular smooth muscle cell;AS:Atherosclerosis.

然而,LncRNA在血管內皮細胞eNOS/NO信號通路中的作用仍不明確。僅有個別研究指出,LncRNA-uc001pwg.1可以在由人誘導多能干細胞分化而來的內皮細胞中上調eNOS/NO通路[27];STEEL(splicedtranscriptendothelial-enriched lncRNA)與LEENE(lncRNA that enhances eNOS expression)能夠上調eNOS的表達[28-29]。因此,本研究結合既往發現并以此為基礎,尋找并驗證心血管疾病相關LncRNA中調控eNOS/NO的分子,為今后以eNOS/NO為靶點進一步探究防治心血管疾病的新策略提供實驗依據。

材 料 和 方 法

主要材料小鼠主動脈內皮細胞(mouse aorta endothelial cells,MAECs)購于江蘇齊氏生物科技有限公司;內皮細胞專用培養基(endothelial cell medium,ECM)購于美國ScienCell公司;OptiMEM培養基購于美國Gibco公司;生物基質膠(BD356234 Matrigel)購于美國Corning公司;Trizol試劑、逆轉錄試劑(RrimeScript RT Master Mix)、PCR試劑(SYBR Premix Ex Taq)購于日本Takara公司;PCR相關引物由上海生工生物工程股份有限公司構建并完成測序;eNOS與p-eNOS單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司;GAPDH內參抗體以及二抗購于美國Proteintech公司;RIPA裂解液、細胞與組織裂解液(NO檢測用,S3090)、總NO檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

慢病毒質粒構建慢病毒質粒由上海吉滿生物科技有限公司構建,并完成測序、PCR驗證與滴度測定。慢病毒作為載體攜帶有包括:空白質粒(Negative control,NC)、LncRNA-Beta2.7過表達質粒(LncRNA-Beta2.7)、LincRNA-p21干擾質粒(shLincRNA-p21)、LncRNA-ANRIL干擾質粒(shLncRNA-ANRIL)和LncRNA-H19過表達質粒(LncRNA-H19)。其中,空白質粒、LincRNA-p21干擾質粒與LncRNA-ANRIL干擾質粒攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和嘌呤霉素抗性基因;LncRNA-Beta2.7過表達質粒和LncRNA-H19過表達質粒攜帶有嘌呤霉素抗性基因。

細胞培養與穩定感染MAECs由含5%胎牛血清、1%內皮細胞生長補充劑和1%青/鏈霉素雙抗的ECM培養基培養于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中,待細胞融合度達到80%～90%時按1∶3進行傳代,取第3～7代細胞用于后續實驗。取部分第3代細胞在細胞融合度達到30%～40%時,將培養基置換為預先混勻有攜帶相應基因序列的慢病毒原液的新鮮培養基,48 h后換液;再經24 h后傳代,并在培養基中加入2 ng/mL的嘌呤霉素進行細胞篩選,從而構建穩定感染的細胞株。

熒光定量PCRTrizol法提取內皮細胞總RNA,測定樣品濃度與純度后應用RrimeScript RT Master Mix (配成反應體系逆轉錄總RNA為cDNA,反應條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。得到cDNA樣品經適當稀釋后(1∶3)應用SYBR Premix Ex Taq 配成RCP體系,上機。eNOS上游引物:5’-CAGTGTCCAACATGCTGCTGGAAATTG-3’,下游引物:5’-TAAAGGTCTTCTTCCTGGTGATG-CC-3’;GAPDH上游引物:5’-TGAAGGTCGGTG-TGAACGGATT-3’,下游引物:5’-CGTGAGTGG-AGTCATACTGGAACA-3’。擴增條件為:第一階段:95 ℃ 30 s;第二階段:95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,共40個循環。eNOS mRNA的表達水平以GAPDH為內參進行標準化,以2-△△CT值進行統計分析。

Western blotRIPA裂解液(添加1∶100 PMSF、1∶100 PI)提取細胞總蛋白,取上清加入上樣緩沖液煮沸變性。得到總蛋白樣品經BCA測定濃度后取10 μg經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,70 V恒壓濕轉至PVDF膜。而后使用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗(eNOS:1∶2 000;p-eNOS:1∶1 000;GAPDH:1∶5 000) 4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育45～60 min后曝光顯色。目的蛋白的表達水平以GAPDH為內參進行標準化。

間接法檢測NO收集細胞培養液上清,每組60 μL;S3090裂解液裂解細胞所得樣品,每組取20 μL經1∶3稀釋。按照總NO檢測試劑盒說明書的流程,采用還原比色法檢測NO的含量。

劃痕實驗取6孔板,預先在背面用馬克筆做好標記。完成慢病毒穩定轉染的MAECs,取對數生長狀態的細胞,再次傳代并將細胞鋪板。在細胞密度達到80%～90%時,使用200 μL無菌槍頭在各孔底面劃出豎直且平行的劃痕。穩定培養2 h (作為0 h),之后每隔12 h在倒置顯微鏡下觀察一次。參考馬克筆所做的標記于固定位置觀察,并拍照記錄。

小管形成實驗預先在冰浴條件下,于96孔板中均勻加入用OptiMEM培養基1∶1稀釋的生物基質膠(BD Matrigel) 100 μL,37 ℃孵育30 min。完成慢病毒穩定轉染的MAECs,取對數生長狀態的細胞。終止消化后稀釋為1×105個/mL的細胞懸液,取100 μL覆蓋于基質膠表面,放入細胞培養箱孵育。3 h后在Olympus BX43倒置熒光顯微鏡下觀察,并拍照記錄。應用Image J Angiogenesis analyzer軟件對所得圖像進行分析,采用小管數目(Nb branches)、小管總長度(Tot.length)、分支點數(Nb Junctions)作為量化指標。

結 果

穩定轉染小鼠主動脈內皮細胞原代培養小鼠主動脈內皮細胞生長狀態良好,呈不規則的梭形。通過嘌呤霉素篩選、傳代后,在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到細胞內GFP表達率高,病毒轉染效率可達90%以上。熒光定量PCR的結果顯示:與對照組相比,LncRNA-Beta2.7過表達組LncRNA-Beta2.7的表達顯著升高(P=0.047),LincRNA-p21敲低組LincRNA-p21的表達顯著降低(P=0.032),LncRNA-ANRIL敲低組LncRNA-ANRIL的表達顯著降低(P=0.009),LncRNA-H19過表達組LncRNA-H19的表達顯著升高(P=0.029),差異均具有統計學意義(圖1)。

圖1 穩定轉染小鼠主動脈內皮細胞及其
LncRNA過表達/敲低效率
Fig 1 Stably transfected MAECs and the LncRNAoverexpression/knockdown efficiency

LncRNA對內皮細胞eNOS mRNA表達的影響熒光定量PCR的結果顯示:與空白組相比,陰性對照組、LincRNA-p21敲低組、LncRNA-ANRIL敲低組的eNOS mRNA的表達水平無明顯改變;LncRNA-Beta2.7過表達組eNOS mRNA表達顯著升高(P=0.002),差異具有統計學意義;LncRNA-H19過表達組的eNOS mRNA表達下降(P=0.007),差異具有統計學意義(圖2)。

圖2 小鼠主動脈內皮細胞eNOS mRNA的表達水平
Fig 2 The mRNA expression of eNOS in MAECs

LncRNA對內皮細胞eNOS/p-eNOS蛋白表達的影響Western blot結果顯示:與空白組相比,陰性對照組、LincRNA-p21敲低組、LncRNA-ANRIL敲低組、LncRNA-H19過表達組的eNOS蛋白的表達水平無明顯改變,而LncRNA-Beta2.7過表達組eNOS 蛋白的表達顯著升高(P=0.036);另外,與空白組相比,陰性對照組、LncRNA-Beta2.7過表達組、LncRNA-ANRIL敲低組、LncRNA-H19過表達組的p-eNOS/eNOS比值無明顯改變,而LincRNA-p21敲低組的p-eNOS/eNOS比值則顯著升高(P=0.008)(圖3)。

LncRNA對內皮細胞內NO含量及其分泌水平的影響各組內皮細胞內的NO水平均無明顯差異;而與空白組相比,LncRNA-Beta2.7過表達組中培養基上清液中的NO水平則有顯著升高(P=0.019),差異具有統計學意義(圖4)。

LncRNA-Beta2.7對內皮細胞遷移與血管形成能力的影響劃痕實驗結果顯示:相比于對照組,LncRNA-Beta2.7過表達組的MAECs傷口愈合速率在12 h和24 h都有顯著提高(P均<0.001);小管形成實驗的結果顯示:相比于對照組,LncRNA-Beta2.7過表達組的MAECs在單位視野內形成的小管分支數無明顯改變(P=0.970),而在小管的總長度和分支點數上顯著升高(P=0.009,P=0.020)(圖5)。

圖3 小鼠主動脈內皮細胞eNOS、p-eNOS蛋白的表達水平
Fig 3 The protein expression of eNOS and p-eNOS in MAECs

圖4 小鼠主動脈內皮細胞內NO含量以及NO的分泌水平
Fig 4 The NO production and secretion in MAECs

圖5 劃痕實驗和小管形成實驗
Fig 5 Wound healing assay and tube formation assay

討 論

本研究結合既往發現并以此為基礎,篩選動脈粥樣硬化相關的LncRNA。在獲得可靠的LncRNA全長序列后,結合慢病毒構建可行性,構建了相應LncRNA的干擾與過表達載體。未能獲得可靠的Tie-1-AS全長序列,MALAT1全長序列過長無法插入質粒等原因使得我們無法考察其對內皮細胞eNOS表達的影響?；趧屿o脈不同的生理組成,為了使細胞實驗更接近體內的生理病理狀態,本研究選用了原代的MAECs。

本研究首先發現LncRNA-Beta2.7能夠上調內皮細胞eNOS/NO信號通路。通過慢病毒穩定轉染實現的過表達LncRNA-Beta2.7上調了eNOS mRNA與蛋白的表達,且同步上調eNOS的磷酸化,使得p-eNOS/eNOS比值保持不變,從而上調NO的產量。既往研究表明,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的許多生物學功能依賴于eNOS的活性被激活[30],包括誘導血管內皮細胞的增殖、遷移、分化和血管形成等[31-32]。為了進一步驗證LncRNA-Beta2.7上調eNOS/NO通路在內皮細胞中發揮的作用,我們使用穩定過表達LncRNA-Beta2.7的內皮細胞進行功能學實驗,包括劃痕實驗與小管形成實驗。發現過表達LncRNA-Beta2.7上調了內皮細胞劃痕愈合速率和小管形成水平,表明LncRNA-Beta2.7能夠影響內皮細胞的遷移與血管形成能力,這與其對eNOS/NO信號通路的調控作用相符合。而在既往研究中有學者發現LncRNA-Beta2.7可以幫助內皮細胞抵御缺血再灌注損傷,是一種保護性分子[17,33],與本研究結果基本一致。

除此之外,我們還發現了敲低LincRNA-p21在不影響eNOS mRNA和蛋白表達水平的情況下,能夠上調eNOS的磷酸化水平,這與既往研究中LincRNA-p21促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的表現相符合[22,34]。但在后續實驗中,敲低LincRNA-p21上調NO分泌水平的表現卻并不穩定,缺乏統計學意義。既往研究指出LncRNA-H19能夠促進血管平滑肌細胞增殖,引起血管重構[20-21],而我們發現過表達LncRNA-H19能夠下調內皮細胞內eNOS的mRNA水平,但在后續實驗中LncRNA-H19并沒有影響eNOS蛋白的表達、磷酸化以及NO的含量。我們推測這可能是由于在生理狀態即非病理模型中改變LncRNA的表達水平對eNOS/NO的調控作用有限。在本研究中,LncRNA-ANRIL對內皮細胞eNOS的表達、NO的含量及其分泌水平沒有產生顯著的影響。

綜上所述,本研究發現了LncRNA-Beta2.7在內皮細胞可以上調eNOS/NO的表達以及內皮細胞的遷移和血管形成能力。這提示了LncRNA-Beta2.7可能起到保護血管內皮、阻止動脈粥樣硬化等心血管疾病發生發展的的作用,為今后進一步探究如何保護內皮功能障礙,防治心血管疾病提供了新的思路和實驗依據。此外,LncRNA-Beta2.7如何實現對eNOS的表達及其磷酸化的調控,是否還有其他靶基因參與了血管內皮功能的調節,均值得進一步研究和探討。