2018年北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒gE、gB蛋白抗體ELISA檢測(cè)及分析

魏 其，楊慧敏，屈勇剛，谷思穎，任 敏，吳圓圓，于會(huì)舉

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.石河子市添元生物科技有限公司，石河子 832000）

豬偽狂犬病（Pseudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種急性、熱性和高度接觸傳染性疾病，已對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅。豬是該病毒的儲(chǔ)存宿主[1]，豬感染PRV后會(huì)出現(xiàn)腦脊髓炎、奇癢、發(fā)熱等臨床癥狀，妊娠母豬易引起流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，仔豬感染后死亡率可達(dá)到100%[2]，因此加大了根除該病的工作難度。豬偽狂犬病的診斷可以通過(guò)多種血清學(xué)診斷方法，其中血清中和試驗(yàn)具有較強(qiáng)的靈敏性和特異性，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定的診斷方法。目前，豬偽狂犬病基因缺失疫苗主要缺失的糖蛋白基因?yàn)間B和gE基因，利用大腸桿菌和酵母等表達(dá)系統(tǒng)對(duì)缺失的糖蛋白進(jìn)行表達(dá)并建立了相應(yīng)的鑒別診斷方法：gB-ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）、gE-ELISA等，試驗(yàn)通過(guò)驗(yàn)證并證實(shí)這些方法具有很強(qiáng)的特異性及很高的靈敏性且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快捷[3]。

為調(diào)查北疆地區(qū)豬群PRV野毒感染情況，本試驗(yàn)在2018年2—11月期間從北疆地區(qū)的6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)共采集血樣401份，應(yīng)用豬偽狂犬病病毒gB、gE抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)其抗體情況進(jìn)行檢測(cè)，為北疆甚至是新疆各豬場(chǎng)的PR預(yù)防和凈化工作提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2018年2—11月采自北疆地區(qū)（石河子、伊犁、塔城、昌吉）的6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)共401份血樣，其中21日齡仔豬40份，保育豬50份，肥育豬40份，后備豬114份，母豬85份，公豬72份。采血后置于4℃保存，分離血清檢測(cè)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器和材料 豬偽狂犬病病毒gB（PRV-gB）抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒gE（PRV-gE）抗體檢測(cè)試劑盒，兩種試劑盒均由北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司生產(chǎn)；微量移液器（Eppendorf）、自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將獸用采血器中的血清分離至EP管中，2 000 r/min離心2 min，立即檢測(cè)或放到4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法 按照上述ELISA試劑盒說(shuō)明書對(duì)401份血清進(jìn)行PRV-gB、PRV-gE蛋白抗體水平檢測(cè)。在室溫條件下，被檢樣品及對(duì)照組需要用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，體積比為1∶1。取100 μL處理好的樣品及對(duì)照組加入抗原包被板中，陰陽(yáng)對(duì)照各設(shè)兩組，室溫孵育（60±5）min或4℃過(guò)夜孵育，加入洗滌液進(jìn)行洗滌，最后一次洗滌后將板中的殘留液體在吸水材料上扣干，避免對(duì)抗原抗體結(jié)合造成影響，然后每孔加入100 μL的酶標(biāo)抗體，抗原抗體在室溫下結(jié)合（20±1）min后重復(fù)洗滌步驟，室溫條件下加入100 uL的底物液，避光顯色（15±1）min后加入50 μL終止液，使反應(yīng)終止，10 min內(nèi)應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定 檢測(cè)出每孔OD650nm的值，判定本試驗(yàn)成立的條件：陰性對(duì)照平均OD650nm值減去陽(yáng)性對(duì)照平均OD650nm值差必須≥0.30，否則結(jié)果不成立。

每孔OD650nm的值用S表示，N為陰性對(duì)照OD650nm值的平均數(shù)。

若S/N＞0.70判定gB/gE檢測(cè)結(jié)果為陰性；S/N≤0.60為陽(yáng)性；介于兩者之間結(jié)果為可疑。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)算gE、gB抗體的陽(yáng)性率、陰性率、可疑率以及S/N的均值，并用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 北疆地區(qū)6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)PRV-gB蛋白抗體水平

對(duì)北疆地區(qū)6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)（A～F）401份血樣進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRV-gB抗體陽(yáng)性有374份，平均陽(yáng)性率為93.27%。A～F場(chǎng)gB抗體的陽(yáng)性率依次為99.04%、93.33%、55.00%、100.00%、99.40%、83.33%，C 場(chǎng)的陽(yáng)性率最低，為 55.00%，D 場(chǎng)的最高，為 100.00%。A～F各豬場(chǎng)的 S/N 的均值依次為 0.101 7、0.116 4、0.497 1、0.087 1、0.071 3、0.212 8，所有值均小于 0.60，最小值為 0.071 3，最大值為 0.497 1。結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒gB蛋白抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

不同豬場(chǎng)之間豬偽狂犬病病毒gB蛋白平均抗體水平存在差異，C 場(chǎng)和 A、B、D、E、F 5個(gè)場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；F 場(chǎng)和 A、D、E 3 個(gè)場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；B場(chǎng)和E場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；A場(chǎng)和D、E兩個(gè)場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 豬場(chǎng)間豬偽狂犬病病毒gB蛋白平均抗體水平多重比較

2.2 北疆地區(qū)6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)PRV-gE蛋白抗體水平

檢測(cè)A～F規(guī)模化豬場(chǎng)的PRV-gE蛋白抗體水平發(fā)現(xiàn)，PRV-gE抗體陽(yáng)性有181份，陽(yáng)性率為45.14%。A～F的6個(gè)豬場(chǎng)檢出gE抗體的陽(yáng)性率依次為 21.15%、4.44%、0%、57.14%、86.23%、8.33%，很明顯C養(yǎng)殖場(chǎng)的陽(yáng)性率最低0，E場(chǎng)的陽(yáng)性率最高為86.23%。A～F 各豬場(chǎng) S/N 的均值為 0.858 2、0.938 3、1.020 0、0.466 0、0.282 0、0.838 0，其中 D、E 場(chǎng)的值均小于0.60，其余4組值均大于 0.70，最小值為0.282 0，最大值為 1.020 0。結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

不同豬場(chǎng)之間豬偽狂犬病病毒gE蛋白平均抗體水平存在差異，E 場(chǎng)和 A、B、C、D、F 5 場(chǎng)差異顯著；D 場(chǎng)和 A、B、C、F 4 個(gè)場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；F 場(chǎng)和C場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；A場(chǎng)和C場(chǎng)差異顯著（P＜0.05）；B 場(chǎng)和 A、C、F 3 個(gè)場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05）；A場(chǎng)和F場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 豬場(chǎng)間豬偽狂犬病病毒gE蛋白平均抗體水平多重比較

2.3 不同類別豬群的PRV-gB、PRV-gE 蛋白抗體水平

將北疆地區(qū)的6個(gè)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)按照其不同類別的豬群來(lái)分別檢測(cè)其gB抗體水平，在401份樣品中檢測(cè)出376份陽(yáng)性血樣，陽(yáng)性率為93.77%。經(jīng)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)21日齡仔豬、保育豬、肥育、后備豬、母豬、公豬的gB蛋白抗體陽(yáng)性率分別為97.50%、92.00%、100.00%、84.21%、97.65%、100.00%，在這6類豬群中PRV-gB蛋白抗體陽(yáng)性最高的有肥育豬、公豬均為100%，其次是母豬為97.65%，后備豬檢出的陽(yáng)性率最低為 84.21%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 試驗(yàn)豬場(chǎng)不同類別豬群的PRV-gB蛋白抗體水平

檢測(cè)21日齡仔豬、保育豬、肥育豬、后備豬、母豬、公豬這6種類別豬群的gE抗體水平，總體的gE蛋白抗體陽(yáng)性率為39.15%，其中檢出陽(yáng)性率最高的是公豬為68.06%，其次是母豬為56.47%，而保育豬的gE蛋白抗體陽(yáng)性率最低為12.00%，其余的21日齡仔豬、肥育豬、后備豬的gE蛋白抗體陽(yáng)性率依次為30.00%、12.50%、32.46%。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 試驗(yàn)豬場(chǎng)不同類別豬群的PRV-gE蛋白抗體水平

3 討論與分析

3.1 北疆地區(qū)各豬場(chǎng)及不同類別豬群PRV-gB蛋白抗體水平

豬偽狂犬病病毒只有一種血清型，但不同毒株的毒力有所差異。該病毒對(duì)外界的抵抗能力較強(qiáng)，因此要提前做好仔豬的免疫工作，疫苗毒會(huì)搶先與機(jī)體的天然靶位產(chǎn)生“占位效應(yīng)”，降低野毒感染風(fēng)險(xiǎn)[4]。應(yīng)用PRV-gB蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)采集的401份血樣進(jìn)行檢測(cè)，在北疆地區(qū)的6個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)中有374份檢出PRV-gB抗體陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率為93.27%。從這些養(yǎng)殖場(chǎng)不同類別的豬群來(lái)看，有376份檢出PRV-gB抗體陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率達(dá)到93.77%，但其中C場(chǎng)的陽(yáng)性率較低為55.00%，因此對(duì)于C場(chǎng)，若該豬場(chǎng)為凈化豬場(chǎng)（未接種PR疫苗）則gB抗體陽(yáng)性率屬正常，凈化工作良好，若為免疫豬場(chǎng)則gB抗體陽(yáng)性率較低，需加強(qiáng)免疫工作。從不同日齡豬群的PRV-gB蛋白抗體水平分析，后備豬的gB蛋白抗體陽(yáng)性率最低為84.21%，陽(yáng)性抗體水平基本在一個(gè)高度。總體來(lái)看北疆地區(qū)豬群PRV-gB蛋白的抗體水平較高，免疫效果較好。

3.2 北疆地區(qū)各豬場(chǎng)及不同類別豬群PRV-gE蛋白抗體水平

關(guān)于PRV-gE蛋白抗體檢測(cè)，張魯安[5]在 2005年曾報(bào)道PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率為10.1%，在2013年張倩等[6]通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率為15.42%，2016年劉鴿等[2]檢測(cè)北疆地區(qū)的PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率為14.91%。據(jù)了解本試驗(yàn)的6個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采用的疫苗為PRV-gE缺失株，應(yīng)用PRV-gE蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)抽測(cè)的401份血樣進(jìn)行檢測(cè)，從6個(gè)抽檢的養(yǎng)殖場(chǎng)共檢測(cè)出181份PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率為45.14%；對(duì)不同日齡豬群的PRV-gE蛋白抗體檢測(cè)出157份陽(yáng)性樣品，平均陽(yáng)性率為39.15%，從C場(chǎng)抽測(cè)的血樣中，檢測(cè)PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率最低為0，在不同日齡的豬群中保育豬的PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性率為12.00%。從以上可以看出，PRV-gE蛋白抗體陽(yáng)性水平呈逐年遞增趨勢(shì)，說(shuō)明各豬場(chǎng)存在野毒感染。

3.3 加強(qiáng)豬場(chǎng)凈化及免疫接種工作

通過(guò)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，北疆地區(qū)預(yù)防PR的免疫效果較好，但各豬場(chǎng)仍存有感染的情況，因此要加強(qiáng)免疫接種工作[7]，規(guī)模場(chǎng)豬要增加抗體檢測(cè)頻率，并針對(duì)抗體水平較低的豬群，要盡快補(bǔ)免，及時(shí)淘汰感染PRV的豬和免疫耐受豬，避免感染到偽狂犬病病毒。對(duì)豬場(chǎng)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒，對(duì)于新引入的種豬必須進(jìn)行科學(xué)合理的檢疫后才可入群，若發(fā)現(xiàn)發(fā)病或疑似發(fā)病豬立即緊急加強(qiáng)疫苗接種，提高抗體，抑制野毒的活躍性，并配合消毒等生物防疫機(jī)制，做到及早控制暴發(fā)與避免造成大面積流行[8]。防治豬PRV-gB、PRV-gE的任務(wù)重大，高效的基因缺失疫苗及PRV-gB、PRV-gE蛋白抗體ELISA檢測(cè)方法的聯(lián)合使用是豬PR防治的基礎(chǔ)，同時(shí)結(jié)合生物安全和優(yōu)良的飼養(yǎng)管理等措施[9]，為豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供有效支持。