流行性腹瀉病毒5株豬安徽流行株S基因的克隆與序列分析

潘孝成，沈學懷，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，侯宏艷，周學利，張丹俊

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其可導致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病，尤其以哺乳仔豬受害最嚴重，發病率可達100%，病死率平均為50%，10日齡內哺乳仔豬死亡率可高達90%[1]。PEDV為有囊膜的、不分節段的、單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，編碼有纖突（spike,S）蛋白、小膜（smallenvelope,E）蛋白、膜（membrane,M）蛋白和核衣殼（nucleocapsid,N）蛋白4種主要結構蛋白[2]。PEDVS蛋白對介導宿主中和抗體的產生、免疫介導、特異性受體的結合及促進病毒和細胞膜融合等方面具有重要意義，PEDVS基因在遺傳進化上存在較高的變異性，其基因序列的改變會引起其毒力、抗原表位、病毒嗜性和組織細胞培養特性等的改變[3-4]。因此，對豬流行性腹瀉地方流行毒株的序列分析，旨在了解PEDV遺傳變異規律以及為疫苗研制和開展有效防控提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2018年8—12月在安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所安徽省畜禽疫病研究中心進行。

1.2 主要試劑、材料

RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑盒、Taq酶、pMD-18T載體等購自TakaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α、DNA Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（GARV）的抗原快速檢測試劑盒（膠體金試劑）購自BioNote公司。

1.3 病料

病料樣品為刮取的腸道黏膜，采自安徽省境內疑似發生豬流行性腹瀉的豬場（2013—2017年），發病仔豬臨床表現為水樣腹瀉，腸道出血，用PEDV、TGEV和GARV的膠體金抗原快速檢測試劑盒檢測，結果為PEDV陽性，TGEV和GARV均為陰性。

1.4 引物合成

根據GenBank中已發表的PEDV的S基因序列，設計了 3 對引物，P1、P2，P3、P4 和 P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，3對引物共擴增基因片段長度約4 600 bp，包含PEDVS基因全長（表1）。

表1 引物序列

1.5 RNA提取及cDNA合成

刮取發病仔豬小腸黏膜層，按TakaRa公司RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA，用TakaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit進行反轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。

1.6 PCR擴增

以合成的cDNA為模板，用引物對P1/P2、P3/P4或P5/P6進行PCR擴增，擴增體系為：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 15 μL，擴增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55℃ 50 s，72℃ 2.5 min，31個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。電泳鑒定為陽性的PCR產物，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對PCR產物進行回收，連接pMD-18T載體，轉入DH5α，鑒定的陽性質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.7 基因序列分析

采用 DNA Star、DNAMAN、Genetyx 等軟件，將擴增序列與GenBank中的11個PEDV分離株的S基因序列進行序列比對、同源性分析和遺傳進化分析。所用參考毒株序列見表2。

表2 參考株相關信息

2 結果

2.1 RT-PCR擴增和測序結果

取PEDV膠體金抗原檢測試劑檢測為陽性的，且來自安徽省不同地區5個豬場的樣品用3對引物分別進行進行PCR擴增，電泳結果顯示，3對引物擴增的基因片段大小均約為1 500 bp（圖1），與預期結果相符。測序結果顯示，獲得5株PEDV流行毒株的S基因序列，序列全長均為4 161個核苷酸，編碼1 386個氨基酸，將它們分別命名為AH-CS、AHSC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH。

圖1 PEDV S基因PCR擴增結果

2.2 PEDV S基因核苷酸同源性分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013、MEX-GTO-2014、CV777） 進行S基因核苷酸序列同源性分析，結果見圖2。結果顯示，5株安徽地方流行毒株S基因核苷酸序列之間的同源性為98.7%～99.8%，與經典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）序列同源性較低，為93.6%～94.4%；與2011年后的我國分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美國分離株（IA1 、USA-Colorado-2013）和墨西哥分離株（MEX-GTO-2014）序列同源性較高，為98.1%～99.8%。

圖2 PEDV S基因核苷酸序列同源性分析

2.3 PEDV S基因遺傳進化分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013 、MEX-GTO-2014、CV777）的S基因核苷酸序列進行系統進化樹分析，結果見圖3。進化樹分為G1和G2兩個群，G2又被分為G2a和G2b兩個分支，經典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2010年前我國分離株（LZC和CHS）組成G1群，本試驗分離5株安徽地方流行株均在G2群，其中 4株（AH-CS、AH-SC、AH-NY 和AH-SH）與我國分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012）在 G2b 群，AH-LY與中國分離株（CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美國分離株（IA1、USA-Colorado-2013）和墨西哥分離株（MEX-GTO-2014）在G2a群。

圖3 PEDV S基因的核苷酸序列進化樹

2.4 PEDV S 基因序列分析

將本試驗得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）與參考毒株（AH2012和CV777）的S基因氨基酸序列比對發現，這5株安徽流行毒株氨基酸序列與AH2012高度相似，僅存在6～19個氨基酸的不同；與參考的經典毒株CV777相比，均存在較大差異，存在94～106個氨基酸位點的突變，其中均存在5個氨基酸（58～59位之間插入氨基酸QGVN，135～136位之間插入氨基酸N）的插入和2個氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；氨基酸突變位點主要集中在S1區（1～789aa），占S基因總突變位點的75.47%～81.00%。

3 討論

豬流行性腹瀉病毒的S基因是其基因組中的關鍵毒力基因，PEDV變異主要集中在S基因上，其遺傳變異往往造成毒株毒力和抗原表位等的改變。本研究獲得了5株PEDV安徽流行毒株的S基因全長序列，序列全長均為4 161個核苷酸，編碼1 386個氨基酸，序列比對結果顯示，5株PEDV流行毒株的S基因核苷酸序列高度同源（98.7%～99.8%），與2011年后的國內外分離株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017、IA1、USAColorado-201、MEX-GTO-2014）序列同源性較高，為98.1%～99.8%；與經典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我國分離株（LZC和CHS）序列同源性較低，為 93.6%～94.4%；另外，與 CV777相比，均存在5個氨基酸（58～59位之間插入氨基酸QGVN，135～136位之間插入氨基酸N）的插入和2個氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；序列進化分析也表明，5株PEDV分離株與經典毒株、疫苗株和2011年前我國分離株的親緣關系較遠。這與毛黎紅等、陳慧娟等、王隆柏等、吳旺霞等、王飛等的研究結果一致[5-10]。綜上推測，2011年以來我國PEDV主要流行毒株有相同的毒株來源，且較之前發生了較大的變異；2011年至今中國PEDV流行毒株無較大差異，且與2011年后世界各國的主要流行毒株同源性較高、親緣關系較近。但2011年后世界各國主要流行PEDV毒株的來源仍需進一步研究。

2010年底開始，豬流行性腹瀉在我國呈暴發性流行，2011—2012年流行面積進一步擴大，疫情繼續蔓延，一些地區流行較為嚴重[11-13]，2013年、2014年豬流行性腹瀉更是肆虐全球[14-15]，給世界養豬生產者造成巨大的經濟損失。雖然近年來我國豬流行性腹瀉疫苗的使用較為廣泛，但豬流行性腹瀉在我國發生呈現常態化，在秋、冬、春季十分常見，其危害仍然十分嚴重[16]，這可能與 2011年后我國豬流行性腹瀉主要流行毒株較以往毒株和疫苗株出現了較大變異有關，這就需要開展豬流行性腹瀉防控時，不但要做好生物安全，同時要選擇合適的疫苗進行免疫。