超高效液相色譜串聯質譜法檢測貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量

趙雅楠 閆玉杰 楊趙偉 馬珊珊

河北省秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心,河北秦皇島066004

氯霉素類藥物（Chloramphenicols，CAPs）主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟甲砜霉素（Florfenicol，FF），又稱為酰胺醇類，屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，對家禽、家畜、水產品及蜂蜜制品傳染病的控制和治療具有重要作用。研究發現，氯霉素可抑制骨髓細胞內蛋白質的合成，對人類和動物的骨髓細胞和肝細胞具有毒性作用，不僅可引起細胞減少性貧血、血小板減少和再生障礙性貧血，還可導致嚴重的胃腸道反應、二重感染、外周神經炎、灰嬰綜合征等，長期微量攝入氯霉素不僅使沙門氏菌、大腸桿菌等產生耐藥性，而且還會導致機體正常菌群失調，使人們易患各種疾病。氟甲砜霉素的抗菌譜與氯霉素相似，但其抗菌活性優于氯霉素，對大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏桿菌等有效，但其具有胚胎毒性[1-2]。隨著人們生活水平的提高，動物性食品的食用安全越來越受關注。為保障動物源食品的安全，確保該類藥物不對人類健康帶來威脅，世界各國都對其做出了嚴格規定，嚴禁氯霉素在食用動物上使用，我國農業部235 號公告中將氯霉素列為禁用藥物，規定氟甲砜霉素的在其他動物組織中最高殘留限量為100 μg/kg。

動物性食品中氯霉素殘留超標主要是違法添加和環境污染所致。現代養殖業大部分都采取集約化養殖，飼養密度過高，從而導致多種疾病的傳播。氯霉素雖然屬于禁用藥物，但由于其價格低、見效快，其違規使用現象仍然存在于畜禽養殖過程中；其次，由于飼喂的飼料、飲水等受到污染或是人為因素導致的藥物在飼料中殘留；此外部分養殖人員對相關法律法規和獸藥殘留危害認識不夠，用藥過量或休藥期內屠宰也會造成動物性食品中氯霉素的殘留。

目前，關于氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留的檢測方法包括微生物法、酶聯免疫法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等，但殘留檢測對象主要集中于蜂蜜、水產品以及肉、蛋、乳制品等[3]。本研究建立了一種針對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的超高效液相色譜串聯質譜的檢測方法，簡化了GB/T22338—2008 的前處理方法，優化了液相和質譜方法，能有效消除樣品在提取過程中的損失，縮短檢測時間，減少有機試劑消耗，為評估氯霉素、氟甲砜霉素在食用類貉子肉中殘留提供檢測參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗樣品。從河北省秦皇島市昌黎縣下屬的10 個鄉鎮選取各60 份屠宰取皮后的貉子肉，放于塑封袋里包好，-80 ℃冷凍保存。采樣地點和樣品編號見表1。

表1 貉肉采樣地點和樣品編號

2）試驗儀器。超高效液相色譜串聯質譜儀UPLC XEVOTQ，Waters；CP214 電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；SB-5200DT 數控超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；SPT-16 氮空吹掃濃縮儀，北京斯珀特科技有限公司；GX274 固相萃取儀，法國吉爾森公司；固相萃取柱，200 mg，3 mL，Waters。

3）試劑。標準品：氯霉素，99.5%，中國獸醫藥品監察所；氯霉素D5內標物，100 ng/mL，德國；氟甲砜霉素，100 μg/mL，農業農村部環境保護科研檢測所。乙腈，色譜純，Fisher；正己烷，色譜純，Fisher；丙酮，色譜純，Fisher；試驗用水為一級水。

1.2 試驗方法

1）樣品前處理。從河北省秦皇島市昌黎縣10 個鄉鎮采取的貉子腿中隨機選取60 個樣品進行檢測。稱取5.0 g 試樣于50 mL 離心管中，加入50 μL 1 μg/mL 氯霉素D5內標工作液和25 mL 乙腈，超聲提取10 min，8 000 r/min 離心10 min，吸取10 mL 上清液于另一個50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈飽和正己烷，充分搖勻，靜置5 min，吸取5 mL乙腈層于10 mL 離心管中，氮氣吹干，加5 mL 的丙酮-正己烷（體積比1∶9）溶解。

丙酮-正己烷（體積比1∶9）溶液5 mL 淋洗小柱，棄去淋洗液，加入殘渣溶解液，棄去流出液，加入5 mL 丙酮-正己烷（體積比6∶4）溶液，收集洗脫液，氮氣吹干，加1 mL 的20%乙腈溶液，過0.22 μm 濾膜后上機測定，同時制備空白基質液和陽性添加樣品，采用與樣品相同處理方法。

2）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈和一級水，洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

3）質譜條件。電噴霧離子源（ESI-）；離子源溫度：150 ℃；檢測方式：多反應監測；毛細管電壓：2.60 kV；去溶劑氣：高純氮氣；去溶劑氣流量：1 000 L/h；去溶劑氣溫度：500 ℃；碰撞氣：氬氣；錐孔氣：高純氮氣；錐孔氣流量：50 L/h；氯霉素、氟甲砜霉素及氯霉素內標物的質譜參數表見表3。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

通過反復試驗梯度洗脫條件，實現了3 種物質的分離，排除干擾，在5 min 之內完成對藥物的檢測（表2）。本試驗優化的色譜條件，在流動相中不添加乙酸銨，也能獲得良好的峰形及優異的檢測靈敏度。

表3 質譜采集參數表

試驗發現采用不同的溶劑作為標準稀釋液或樣品處理后的復溶溶液會對質譜響應及色譜峰形產生顯著影響。比例過高的有機溶劑能明顯增強質譜響應，但同時也會造成部分化合物的色譜峰形坍塌。經多次試驗，確定以20%乙腈溶液作為樣品處理后復溶及標準溶液配制用溶液，可獲得對稱、尖銳的峰形和良好的質譜響應。

2.2 質譜條件的優化

氯霉素類化合物因含有酚羥基，而適合在ESI源的負離子模式下離子化。在負離子化模式下，分別將3 種物質以0.5 μg/mL 的標準溶液注入質譜儀進行質譜參數的優化。先通過母離子全掃描確定化合物的分子離子峰，以此作為母離子，再對離子源參數進行優化，比較不同錐孔電壓下的母離子強度，確定母離子達到最大響應值時的最佳錐孔電壓值。然后對母離子作子離子全掃描，確定每種氯霉素類藥物的碎片離子信息，并選擇離子豐度較高、干擾較小的2 個特征碎片子離子作為各個目標化合物的定性離子，同時對碰撞能量進行優化，確定碎片離子有最大響應強度時的最佳碰撞電壓值，最后得到該化合物的2 個MRM 離子對及相應的質譜參數,這與前人所操作類似試驗得到的結果近似[4-6]。根據電離機制，以利于化合物去質子化的乙腈作為有機相，可改善該類化合物在負離子模式下的離子化效率。試驗驗表明，與標準GB/T 22338—2008 中以乙酸銨、乙腈和水為流動相比較，單純以水和乙腈為流動相時，氯霉素類化合物的響應無明顯差異，因此，本方法選擇乙腈和水為流動相，以減少有機鹽對色譜柱的損傷。

2.3 提取過程的優化

預試驗采用標準GB/T 22338—2008 的前處理方法，添加檢測回收率達到58%，分析回收率偏低的原因，可能主要由于試驗的前處理過程中分液漏斗使用過多及旋轉蒸發的溶液量較大造成的損耗。為提高樣品回收率，通過借鑒其他提取方法，經過數次改進，添加陽性樣品的回收率有了明顯的提高趨勢，達到68%～115%。

本試驗使用的化合物屬于弱極性化合物，常用的提取溶劑涉及甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，本試驗只考察常用提取溶劑乙腈、乙酸乙酯的提取效果。試驗發現乙腈與乙酸乙酯的提取回收率相當；但用乙酸乙酯提取的溶劑顏色略深，說明溶液中帶出了一些弱極性基質成分，這將增加后續凈化的難度；乙腈在有效提取目標物的同時具有沉淀蛋白的作用，且帶出的弱極性成分大大減少，因而選用乙腈作為本研究的提取溶劑。

2.4 線性關系

準確移取適量標準溶液，制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL 的6 個質量濃度水平的混合標準工作液，其中內標物質量濃度為10 ng/mL，按優化好的條件進行測定，得線性回歸方程，其相關系數均在0.999 以上，表明各化合物在相應濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.5 檢測限與定量限

將加標濃度逐級稀釋添加于空白樣品中測定信噪比，最終以3 倍信噪比確定該方法的檢測限，以10 倍信噪比確定該方法定量限，從而得出氯霉素和氟甲砜霉素的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

向空白樣品中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg 3 個濃度水平的混合標準溶液，每個濃度水平做4 個平行，試驗結果表明，氯霉素平均回收率在68%～99%；氟甲砜霉素平均回收率在70%～115%，測定結果相對偏差均小于10%，相應MRM 圖見圖1。

2.7 檢測結果

60 個被測樣品中，除了H83 檢出氯霉素含量（0.105 μg/kg）超過最低檢測限0.1 μg/kg 外，其余樣品均未檢出氯霉素和氟甲砜霉素，占被檢測樣品的1.5%。

3 討 論

圖1 貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素和氯霉素內標物D5 的MRM 圖

本研究建立了一種采用超高效液相色譜串聯質譜儀對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量進行定性和定量檢測的方法。以氘代氯霉素（D5-CAP）為內標，樣品經乙腈提取，乙腈飽和正己烷除脂，固相萃取柱凈化后，采用多反應監測（MRM）負離子模式，對貉子肉中氯霉素、氟甲砜霉素的殘留量進行定量檢測。結果表明，2 種藥物在0.1～5.0 μg/mL 范圍內均呈現良好線性關系，相關系數 均大于0.999。樣品中氯霉素和氟甲砜霉素的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，本方法在0.5～2.0 μg/kg 添加范圍內藥物回收率為68%～115%，其相對偏差均小于10%。該方法具有簡便快捷、準確度高、精密度好、損耗少和定量更準確等優點。試驗還對河北省秦皇島市昌黎縣10 個鄉鎮貉子肉中氯霉素和氟甲砜霉素殘留數據進行分析，了解昌黎縣貉子肉中氯霉素類藥物的殘留狀況，評估食用貉子肉內殘留，并對市場提出潛在風險預警。