HPLC法同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量Δ

陸文瑾，竇志華，曹瑞，倪麗麗，戴瑩（1.宜興市第二人民醫院藥劑科，江蘇宜興214221；2.南通大學附屬南通第三醫院藥學部，江蘇南通 226006；.南京中醫藥大學藥學院，南京 21002）

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）或唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.et Balf.）或藥用大黃（Rheum officinaleBail.）的干燥根和根莖[1]，是世界范圍內廣泛應用的中草藥之一[2-3]。我國國家藥品標準中的800多個中成藥處方中均含有大黃，故其質量的優劣可影響用藥的有效性和安全性[4-5]。2015年全國范圍內的抽檢結果顯示，目前市場上流通的大黃藥材合格率僅約為80%，其檢驗項目包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、土大黃苷檢查、總灰分檢查、游離型蒽醌類成分含量測定等[6]。大黃中含有蒽醌類及蒽酮類、鞣質類、二苯乙烯類、苯丁酮類等非蒽醌類成分[7]，但部分研究僅以大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等蒽醌類成分作為評價大黃質量的指標，存在一定的局限性[8]，而大黃中含有的非蒽醌類成分也同樣具有一定的藥理作用[9]。如蒽酮類成分瀉下作用最強[10]，收斂止血作用主要為鞣質類成分[11]，二苯乙烯苷類成分具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、調脂、預防并治療動脈粥樣硬化作用[12]，苯丁酮苷類是大黃中具有活性的一類重要化合物[13]。2015年版《中國藥典》（一部）[1]僅對大黃藥材中5個游離型蒽醌類成分的含量作出規定：不得少于0.20%，其酸解后的總蒽醌含量不得少于1.5%；《歐洲藥典》（9.0版）[14]也僅規定了總蒽醌含量不得少于2.2%。鑒于對單一組分的檢測尚無法全面評價大黃的質量，因此增加非蒽醌類成分的含量測定對大黃質量標準的完善具有重要意義[15]。

本課題組前期建立了22批大黃藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并在280 nm波長處得到了41個共有峰，通過外標法測定了5個游離型蒽醌和總蒽醌的含量，通過一測多評法測定了8個結合型蒽醌的含量[16]。在此基礎上，本研究建立了同時測定大黃藥材中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷等8個非蒽醌類成分含量的HPLC法，旨在為建立更全面的大黃質量評價標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alliance e2695型HPLC儀，包括e2695型分離單元、2998型二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；BT 25S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號：150226，純度：≥98%）、兒茶素對照品（批號：141224，純度：≥98%）、表兒茶素對照品（批號：140730，純度：≥98%）、表兒茶素沒食子酸酯對照品（批號：140923，純度：≥98%）、番瀉苷A對照品（批號：CHB170508，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品（批號：38963-95-0，純度：98%）、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品（批號：92834097-0，純度：98%）、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷（批號：950184-00-6，純度：98%）均購自上海一林生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

22批大黃藥材中S2、S18、S22為中國食品藥品檢定研究院標準藥材粉末，S21購自南通三越中藥飲片有限公司，其余藥材樣品均由南通市食品藥品監督中心葛建華主任中藥師饋贈。除標準藥材外，其余19批均由葛建華主任中藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃（R.palmatumL.）或唐古特大黃（R.tanguticumMaxim.et Balf.）或藥用大黃（R.officinaleBail.）的干燥根和根莖。除標準藥材粉末，其余藥材均粉碎成粉末，過四號篩，備用。大黃藥材來源見表1。

表1 大黃藥材來源Tab 1 Source of Rheum palmatum

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，5%A→30%A；10～40 min，30%A→60%A；40～60 min，60%A；60～70 min，60%A→100%A；70～80 min，100%A）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：30 μL。在該色譜條件下，分離度均大于1.5，理論板數以沒食子酸計均不低于8 000，空白對照對測定無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取樣品粉末約0.15 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇24 mL，超聲（功率：200 W，頻率：53 kHz）處理30 min，冷卻后，加甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取兒茶素對照品9.35 mg、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品4.6 mg，分別置于2 mL量瓶中；另取沒食子酸對照品6.16 mg、表兒茶素沒食子酸酯對照品4.16 mg、番瀉苷A對照品8.04 mg、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品5.45mg、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷對照品11.72 mg，分別置于5 mL量瓶中；另取表兒茶素對照品5.09 mg，置于10 mL量瓶中；分別加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各單一對照品貯備液。分別精密量取上述沒食子酸對照品貯備液、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷對照品貯備液各0.5 mL，白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品貯備液0.7 mL，兒茶素對照品貯備液0.8 mL，表兒茶素沒食子酸酯對照品貯備液、番瀉苷A對照品貯備液各1.0 mL，4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷對照品貯備液1.25mL，表兒茶素對照品貯備液1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷質量濃度分別為0.061 6、0.374、0.076 35、0.076 3、0.083 2、0.115、0.160 8、0.293 mg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液1 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷質量濃度分別為0.002 464、0.014 96、0.003054、0.003 052、0.003 328、0.004 6、0.006 432、0.011 72 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 空白對照溶液 以甲醇為空白對照。

2.3 線性關系考察

分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液2.5、12.5、25 μL及混合對照品貯備液 5、10、20、30、40 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.4 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷的定量限分別為 3.48、4.30、6.40、4.40、3.39、2.87、8.40、4.95 ng，檢測限分別為2.32、2.58、2.40、2.64、2.26、1.23、4.20、2.97 ng。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下混合對照品貯備液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.66%、1.72%、2.27%、1.76%、2.29%、1.81%、2.53%、1.96%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.1”項下供試品溶液（編號：S21）適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為4.84%、4.20%、4.14%、4.72%、4.16%、4.33%、1.36%、1.96%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取樣品粉末（編號：S21），共6份，每份約0.15 g，精密稱定，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中8個成分的含量。結果，沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰）-葡萄糖苷的平均含量分別為0.442、4.580、0.060、0.314、1.280、0.377、3.953、1.000 mg/g，RSD分別為1.53%、3.65%、1.23%、2.21%、2.29%、1.47%、2.59%、2.91%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品粉末（編號：S21），共6份，每份約0.075 g，分別加入一定量的各單一對照品貯備液適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.9 耐用性試驗

取樣品粉末（編號：S21）適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件[流動相B不同濃度比例（0.05%磷酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.15%磷酸水溶液）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱溫（20、25、30 ℃）]進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中8個成分的含量，結果見表4。結果表明，該方法能夠滿足試驗要求，耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取22批樣品粉末適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算各批樣品中8個成分的含量，結果見表5。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

3 討論

有研究指出，在280 nm波長處，大黃成分檢出最為全面[17]。鑒于此，本研究在200～800 nm波長范圍內對樣品進行了全波長掃描。結果發現，8個待測成分在280 nm波長處均有較強吸收，故選擇280 nm作為檢測波長。同時，筆者又考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液兩種流動相體系對待測成分分離情況的影響。結果發現，以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時的出峰數目較多，且分離度良好，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為本研究的流動相。

雖然有研究采用HPLC法同時測定了大黃中2個蒽酮、3個鞣質和4個苯丁酮類成分含量[18]，4個苯丁酮類成分含量[19]，2個蒽酮和2個鞣質類成分含量[4，20]，1個蒽酮和2個鞣質類成分含量[21]以及2個苯丁酮類和1個二苯乙烯類成分的含量[22]，但均未建立鞣質類成分表兒茶素和二苯乙烯類成分白藜蘆醇4′-O-β-D-（6″-O-沒食子酰）-葡萄糖苷含量的測定方法。本研究結果顯示，大黃藥材樣品中這兩個成分的含量較高，分別為0.060～16.700、0.341～16.966 mg/g，因此有必要對其進行定量分析。

表4 耐用性試驗結果Tab 4 Results of durability tests

表5 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

含量測定結果顯示，22批大黃藥材中8個成分含量存在較大差異，S1、S2、S21中8個成分的含量相對較低，而S3、S4、S14、S17含量相對較高，其含量差異可能與藥材原植物的生長年限有關。本課題組在大黃產區考察發現，藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃的生長年限一般分別為1、3、5年；同一基源、同一產區的成分含量也會存在較大差異，這可能與其生長環境如海拔、經度、緯度、光照、種子遺傳等有關[4，23-24]。

綜上所述，本研究所建方法簡便、準確、專屬性強，可用于同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量。