馬鈴薯高世代選系瘡痂病抗性評價及SSR輔助篩選

宋志軍 白雅梅 張靜華 張 抒 李 輝 呂文河* 魏 琪*

（1 東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030；2 東北農業大學資源與環境學院，黑龍江哈爾濱 150030；3 黑龍江省農業科學院馬鈴薯研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

馬鈴薯瘡痂病是由多種致病鏈霉菌（Streptomyces ssp.）引起的土傳性病害。致病菌侵染部位變形，形成形狀不規則、深淺不一的栓質化病斑，嚴重影響商品品質和加工品質。在中國，馬鈴薯瘡痂病作為次生病害起初未受到重視（魏延安，2005），隨著馬鈴薯種植面積擴大，耕地面積受限，致使連作嚴重，進而導致馬鈴薯瘡痂病逐年加重（何虎翼 等，2017）。

目前，國內外關于馬鈴薯瘡痂病的研究主要集中在病原菌的鑒定和防治上。全世界范圍內，馬鈴薯瘡痂病致病菌大約有50 種（聶峰杰 等，2018），在中國主要有S. scabies、S. turgidiscabies和S. acidiscabies 3 種（張萌 等，2009）。在瘡痂病防治方面，有輪作（Waterer，2002）、土壤熏蒸和種植綠肥（Mishra & Srivastava，2004）及施用微生物菌肥（靳海波 等，2015）等方法，成本高且不能完全防治。篩選抗瘡痂病種質資源，培育抗病新品種，可以有效解決馬鈴薯瘡痂病問題，且節約成本，實現綠色生產，保護環境。目前，高抗瘡痂病的馬鈴薯品種資源較少。Pasco 等（2005）利用人工接種的方式篩選得到Nicola、BF15、Sirtema和Charlotte 4 個高抗瘡痂病品種（系）。何虎翼等（2017）利用田間病圃和人工接種相結合的方式篩選得到D825 和D731 兩個高抗瘡痂病品系。

SSR 分子標記技術是研究作物遺傳多樣性的一種常用方法，在馬鈴薯育種中有廣泛的應用，比如構建遺傳圖譜、分析馬鈴薯資源的遺傳多樣性等（單友蛟 等，2010；石景，2011）。本試驗擬采用田間自然病圃和人工接種兩種方法對20 份馬鈴薯高世代選系進行抗性鑒定，結合瘡痂病指數和相對抗病指數對馬鈴薯材料的瘡痂病抗性進行評價，利用SSR 分子標記分析馬鈴薯品系間的親緣關系，以探究馬鈴薯瘡痂病抗性與親緣關系之間的聯系，為抗瘡痂病育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

自然病圃抗性鑒定試驗于2017 年5～9 月在黑龍江省農業科學院現代化農業示范區馬鈴薯病害研究試驗地進行，該地塊由于馬鈴薯7 a 連作，瘡痂病發病率高。

1.2 試驗材料

供試材料為東北農業大學馬鈴薯研究所提供的20 份高世代選系。在常規育種選擇過程中，一般是早代對薯形、芽眼深淺、匍匐莖長短等性狀進行選擇，而高世代則主要對產量和品質性狀進行選擇。除N08-21-1（中薯3 號×Norland）外，其他品系中至少一個親本是荷蘭品種或利用荷蘭種質資源選育的品種或無性系（表1）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗地塊致病菌鑒定 2017 年9 月，采集試驗地收獲的馬鈴薯瘡痂病的感病塊莖，品種為克新18 號、荷蘭15 號、尤金、興佳2 號、閔薯1 號、延薯4 號、麥肯1 號和克新13 號。每個品種采集1 個塊莖，共8 個。使用無菌毛刷采集每個塊莖表皮上的土壤，8 份土壤樣品混勻為1 份。

將塊莖洗凈，使用75%酒精進行表面消毒，再用無菌水沖洗2 次，晾干。切取瘡痂病病斑下病健交界處薯肉置于少量無菌蒸餾水中，用鑷子碾碎，室溫孵育30 min。將上述液體稀釋1 000 倍后涂布于1%的水瓊脂培養基上，28 ℃條件下暗培養，7～10 d 后挑取全部具有放線菌特征的菌落于酵母麥芽精瓊脂培養基（YME）上畫線純化，連續純化2～3 次。

表1 供試馬鈴薯品系系譜信息

稱取土壤樣品1 g 加入適量無菌水，室溫孵育30 min，6 000 r · min-1離心10 min 后吸取上清液。后續步驟同上。

用稱量勺刮取菌株的菌絲置于無菌離心管中，采用北京莊盟G+細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株DNA。以txtAB 基因特異性引物檢測菌株致病性，采用常規PCR擴增法對菌株進行種類鑒定（邢瑩瑩，2015），引物信息見表2。

表2 病原菌鑒定引物信息

1.3.2 自然病圃抗性鑒定 試驗采用隨機區組設計，單行區，行長5 m，壟距0.8 m，株距0.2 m，即每個小區25 株，4 次重復，采用當地田間管理方式管理試驗區。根據邢瑩瑩（2015）的盆栽接種試驗結果，采用尤金為感病對照，克新18 號為抗病對照。種植120 d 收獲，收獲時調查每個小區所有質量大于50 g 的馬鈴薯塊莖瘡痂病發病情況，調查病斑面積和病斑深度等級。瘡痂病病斑面積等級劃分：0 級，病斑面積為0；1 級，病斑面 積≤5.0%；2 級，5.0%＜病斑面積≤12.5%；3級，12.5%＜病斑面積≤25.0%；4 級，25.0%＜ 病斑面積≤50.0%；5 級，病斑面積＞50.0%。瘡痂病病斑深度等級劃分：1 級，0 mm ≤病斑深 度≤1 mm；2 級，1 mm ＜病斑深度≤2 mm；3級，2 mm ＜病斑深度≤3 mm；4 級，病斑深度＞3 mm。計算每個品種（系）每次重復的瘡痂病指數（scab index，SI）（Singhai et al.，2011；邢瑩瑩，2015）。

參考王躍棟等（2011）的方法，計算相對抗 病 指 數（relative resistance index，RRI），將 供試品種（系）劃分為4 個類型。高抗（HR），0.80 ≤RRI ≤1.00；中抗（MR），0.60 ≤RRI ＜0.80；中 感（MS），0.40 ≤RRI ＜0.60； 高 感（HS），RRI ＜0.40。

病斑面積等級（A）=Σ（各病斑面積等級塊莖數×該級數代表值）/調查塊莖總數

病斑深度等級（D）=Σ（各病斑深度等級塊莖數×該級數代表值）/調查塊莖總數

瘡痂病指數（SI）=100×（A×D）/20

相對抗病指數（RRI）=1-所測品種（系）瘡痂病指數平均值/發病最重品種（系）瘡痂病指數平均值

1.3.3 人工接種鑒定 2018 年，根據自然病圃抗性鑒定結果，從高感、中感、高抗類型中各挑選2 個品系，以尤金為感病對照，克新18 號為抗病對照，參照邢瑩瑩（2015）的盆栽接種方法進行人工接種試驗。試驗土壤采用滅菌后的草炭土，設4 次重復，接種S. scabies 菌種標準菌株。菌株購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌株編號CGMCC 4.1765（=ATCC49173）。使用YME 液體培養基28 ℃、200 r · min-1暗培養9 d，用YME 液體培養基調節菌液濃度至5.0 mg · mL-1（FW）。將菌液與土壤均勻混合，菌液和土壤體積比為1∶4，以無菌水為陰性對照。后期管理參考吳立萍（2017）的方法，種植90 d 后收獲調查，調查方法同自然病圃抗性鑒定。

1.3.4 SSR 親緣關系分析 采用北京康為世紀生物科技有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒分別提取20 個供試品系塊莖的基因組DNA。使用ND-1000 分光光度計檢測DNA 濃度，并稀釋至100 ng · μL-1，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量。

引物采用黑龍江省農業科學院馬鈴薯研究所病蟲害課題組前期試驗篩選得到的9 對高多態性SSR引物（表3），PCR 反應體系參考吳立萍（2017）的方法。擴增產物使用8%、10%、12%濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，采用銀染法染色，不同引物使用聚丙烯酰胺凝膠的濃度見表3。

參考劉思泱（2010）的方法，統計膠片條帶，記錄生成“0，1”矩陣，計算多態性信息量。利用NTSYS-pc 軟件生成遺傳相似性系數矩陣，按UPGMA 法進行聚類 。

表3 SSR 引物名稱及序列

1.4 數據分析

使用Excel 2010 和DPS 7.05 軟件分析試驗數據，使用NTSYS-pc 軟件分析品系間親緣關系。

2 結果與分析

2.1 試驗地塊致病菌鑒定

從土壤和塊莖中共分離純化具有鏈霉菌特征的菌株278 份，其中240 份來自于塊莖，38 份來自于土壤。具有致病力的菌株127 株（表4、圖1），txtAB 基因陽性菌株經種類鑒定（圖2）全部屬于Streptomyces scabies 菌種。

表4 試驗地塊分離菌株致病力檢測結果

圖1 txtAB 基因特異性引物擴增產物電泳圖譜

圖2 S. scabies 特異性引物ScabF/ScabR 擴增產物 電泳圖譜

2.2 自然病圃抗性鑒定

對馬鈴薯品種（系）的瘡痂病指數數據進行方差分析，不同品種（系）間的瘡痂病抗性存在顯著性差異。根據相對抗病指數，可將供試品種（系）劃分為4 個抗病類型（表5）。N11-22-6、N12-39-19、尤金、H04-3-18、N11-40-11、N10-4018、N10-24-2 為高感類型；H09-34012、N12-45-4、N12-39-15、N12-42-18、N12-39-5 為中感類型；N11-46-12、N12-38-1、H04-7-10、克 新18 號、N11-50-29、N08-21-1、H04-7-23、N08-11-9 為中抗類型；N12-38-7、N08-14-1 為高抗類型。在高抗類型中，N08-14-1 的瘡痂病指數顯著低于克新18 號，N12-38-7 的瘡痂病指數與克新18 號沒有顯著差異。中抗品系的瘡痂病指數與克新18 號無顯著差異。中感品系的瘡痂病指數均顯著低于尤金，但是和克新18 號沒有顯著差異。在高感類型中，N11-22-6 的瘡痂病指數最高，顯著高于尤金，其余高感品種（系）的瘡痂病指數與尤金無顯著 差異。

2.3 人工接種抗性鑒定

從表6 可以看出，人工接種的參試品種（系）的瘡痂病指數比自然病圃高，原因可能是人工接種的土壤中致病菌含量高。對人工接種與自然病圃抗性鑒定結果進行相關性分析（圖3），R2為0.946 7，存在極顯著相關，表明人工接種與自然病圃抗性鑒定結果一致。

表5 馬鈴薯品種（系）瘡痂病自然病圃抗性鑒定結果

表6 馬鈴薯品種（系）瘡痂病人工接種抗性鑒定結果

圖3 人工接種與自然病圃抗性鑒定瘡痂病指數相關性 分析結果

2.4 SSR 親緣關系分析

2.4.1 SSR 分子標記多態性 20 份馬鈴薯品系的基因組DNA 經1%瓊脂糖電泳檢驗，條帶清晰，無明顯拖尾。說明DNA 質量較好，可用于下一步SSR-PCR 擴增。本試驗擴增出115 條條帶，其中103 條為多態性條帶，平均多態性比例為89.6%，整體多態性比例較高（表7、圖4）。

表7 SSR 分子標記多態性信息

圖4 引物STM1104 擴增結果

圖5 20 份馬鈴薯品系基于SSR 的親緣關系聚類分析圖

2.4.2 SSR 分子標記親緣分析 由表8可知，20 份馬鈴薯品系的遺傳相似性系數變化范圍為0.487 0～0.860 9。整體看來親緣關系較近。其中N12-45-4與H04-3-18 的遺傳相似性系數最大； N12-38-1 和N12-39-19 的遺傳相似性系數最小。

如圖5 所示，可將20 份馬鈴薯品系分成5 大類。第Ⅰ類包括7 個品系，第Ⅱ類包括6 個品系，第Ⅲ類包括4 個品系，第Ⅳ類包括2 個品系，第Ⅴ類只有1個品系。

對比圖5 和表1 的系譜，SSR 遺傳相似性系數聚類結果與系譜基本一致。第Ⅰ類中，品系H04-7-23、H04-7-10是全同胞姊妹系，遺傳相似性系數為0.808 7；第Ⅱ類中，品系H04-3-18 是N12-45-4 的母本，遺傳相似性系數為0.860 9；第Ⅲ類中，品系N12-39-15、N12-39-19、N12-39-5 是全同胞姊妹系，遺傳相似性系數為0.773 9～0.782 6。但也有親緣關系接近，遺傳相似性系數較小的現象，N12-38-7 與N12-38-1 屬于全同胞姊妹系，但遺傳相似性系數僅為0.626 1，此結果區別于其他幾個全同胞姊妹系，原因可能是同一雜交組合后代發生了較大的遺傳重組和變異。

對比SSR 遺傳相似性系數聚類結果和品系抗病性分類結果（圖5、表5），發現相同抗病類型的品系通過SSR 遺傳相似性系數聚類大致上可聚到一起，如高抗和中抗類型的品系絕大部分聚類到第Ⅰ、Ⅳ類中；高感和中感類型的品系大部分聚類到第Ⅱ、Ⅲ類中。

3 結論與討論

本試驗使用瘡痂病指數評價病情，該方法考慮了病斑面積和病斑深度（類型）兩方面，區別于病情指數僅僅調查病斑面積（張建平 等，2013；孫靜 等，2015）。但是，在抗病性分類方面，僅依據瘡痂病指數還是不能準確評價馬鈴薯品種（系）的瘡痂病抗性。比如，在本試驗中，瘡痂病病斑類型大多數是平狀病斑，導致計算得到的供試品種（系）瘡痂病指數整體較低。有研究表明，瘡痂病發病易受環境影響（何虎翼 等，2017），本試驗通過對比幾個供試品種（系）在自然病圃和人工接種抗性鑒定試驗的結果也發現，不同發病環境下的瘡痂病指數會有整體性地浮動。因此，本試驗采用瘡痂病指數調查病情，使用相對抗病指數衡量供試品種（系）的相對抗病性，在抗病性上進行分類。

表8 20 份馬鈴薯品系的SSR 遺傳相似性系數矩陣表

依據本試驗的抗病性分類方法，在自然病圃與人工接種抗性鑒定試驗中，尤金均表現為高感類型，克新18 號分別表現為中抗和中感類型，這與何虎翼等（2017）和邢瑩瑩（2015）的試驗結果基本一致。本試驗篩選得到N11-46-12、N12-38-1、H04-7-10、N11-50-29、N08-21-1、H04-7-23、N08-11-9、N12-38-7和N08-14-1共9個抗病品系，其中品系N08-14-1 抗性最高，明顯高于抗病對照。

從供試的高世代無性系系譜來看，它們的親本既有中國育成品種，如中薯3 號，又有國外引進品種，如荷蘭的Triplo，美國的Salem，從俄羅斯引進的莫斯科列思基的芽變品種延薯4 號。另外，還包括利用荷蘭種質資源育成的無性系，如H04-7-16。但從遺傳相似性系數變化范圍來看，它們的親緣關系仍然較近。就本試驗而言，可以考慮用第Ⅰ類中的抗病品系H04-7-10、H04-7-23、N11-50-29、N08-11-9 與第Ⅳ類中的抗病品系N12-38-7 和N08-14-1 作為親本雜交進行抗瘡痂病品種選育。今后還應加大對國外，特別是發達國家和國際馬鈴薯中心材料的收集、保存和利用，進一步拓寬育種材料的遺傳基礎。

目前，馬鈴薯瘡痂病抗性機制尚不明確，還未發現相關的抗性基因（徐建飛和金黎平，2017）。馬鈴薯抗瘡痂病育種的主要工作還是利用自然病圃和人工接種鑒定篩選抗病品種（系），耗時長，成本高。本試驗在前人研究的基礎上，探究親緣關系與抗病性的聯系，發現品系間的SSR 遺傳相似性系數聚類結果與瘡痂病抗性分類結果較相符。在今后的抗瘡痂病育種工作中，可以開發更多的SSR引物，根據SSR 遺傳相似性系數聚類結果并結合已知的品種（系）抗性初步篩選，再利用常規鑒定手段進一步篩選，可大大減少工作量。