大白菜根腫病菌生理小種鑒定研究

張淑霞 張清霞 司朝光 李 劍 王殿純 楊曉云*

（1 青島市農業科學研究院，山東青島 266100；2 青島國際種苗有限公司，山東青島 266100）

大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的一種世界性病害。該病為土傳性真菌病害，受侵染的根組織發生異常并大量增生，膨大形成瘤狀腫根，根系正常生理機能受到影響，導致根系生長和吸收能力受損，造成減產或絕收。該病自1936 年在我國臺灣地區發現已來，目前全國大部分地區均有發生，對大白菜生產造成極大破壞。由于該病菌休眠孢子囊能在無寄主的土壤中存活7 a 以上，田間一經發病將長期帶菌，嚴重威脅大白菜的可持續生產，而田間栽培防范、化學藥劑防治該病效果不佳，因此選用抗病品種就成為防治該病的有效方法。

Honig（1931）首次證實根腫病菌存在生理小種分化。目前國際上通用的生理小種鑒別系統有兩個：Williams 鑒別系統（Williams，1966）和歐洲根腫病鑒別系統（ECD）（原玉香 等，2017）。由于后者鑒別品種多達15 個，鑒定用植株多、所需空間大等原因影響了其應用；前者的鑒別品種只有4個，易于操作，結果計算簡單，因而應用較多。國內大多數應用Williams 鑒別系統對大白菜根腫病菌進行生理小種鑒定的報道，均發現了強致病力小種4 號生理小種（丁云花 等，2013；劉峰 等，2013；彭宇龍 等，2018）。但原玉香等（2017）使用ECD鑒別系統鑒定時認為4 號生理小種可進一步劃分為不同的類型。Kuginuki 和Yasuhisa（1999）認為，Williams 鑒別系統和ECD 鑒別系統在鑒定時表現出波動而不能區分出病菌的差別。青島市農業科學研究院大白菜課題組前期利用Williams 鑒別系統對采自全國大白菜主產區及青島市農業科學研究院的16 份大白菜根腫病菌菌源進行生理小種鑒定，并用已育成的抗根腫病大白菜品種同時進行鑒定。結果表現為4 號生理小種居多，但是卻出現了抗4 號生理小種的大白菜品種對來自其他地區的4 號生理小種表現感病的情況。這說明4 號生理小種本身可能存在致病力的分化，或是該鑒別系統未能精確鑒定出生理小種的種類。本試驗繼續采用Williams 鑒別系統，同時選用具有不同根腫病抗性的大白菜品種對來源不同的20 份大白菜根腫病菌進行致病力分化的研究，旨在為大白菜根腫病菌生理小種的精確劃分和抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試根腫病菌菌源采自全國多地，代號及來源詳見表2。所有菌源均經過鏡檢，觀察到休眠孢子囊和游動的休眠孢子，確認為蕓薹根腫菌；-20 ℃冰箱保存。

Williams 鑒別系統的4 個鑒別寄主分別為結 球 甘 藍Jersey Queen 和Badger shipper， 蕪 菁Laurentian 和Wilhelmsburger（表1）。

抗根腫病大白菜品種為青研CR20（青島市農業科學研究院）、金錦（福州建農播王種苗有限公司）、德高CR117（德州市德高蔬菜種苗研究所）、青研CCR69（青島市農業科學研究院）；感病對照（CK）為青研春白1 號（青島市農業科學研究院）。

1.2 試驗方法

試驗于2018 年8 月20 日至9 月25 日在青島市農業科學研究院育苗溫室內進行。將保存于-20 ℃冰箱內的菌根解凍，采用菌土法進行接種。具體步驟：按0.02∶1（質量比）的比例將經攪拌機打碎后的菌根放入基質（品氏托普育苗基質）中混勻過夜，第2 天將基質裝入72 孔穴盤中，播種。每個處理10 株，3 次重復。溫室溫度保持在22～28 ℃，接種35 d 后進行病情調查。

1.3 病情分級標準及Williams 鑒別系統生理小種劃分標準

病情分級標準參考丁云花和簡元才（2005）的標準：0 級，無癥狀；1 級，側根有小腫瘤；3 級，側根和主根上有較大腫瘤，呈圓形；5 級，側根和主根上有大腫瘤，呈紡錘形；7 級，側根和主根上的紡錘形腫瘤連成片；9 級，腫瘤擴展至下胚軸，側根和主根全部為大塊腫瘤。

根據各根腫病菌菌源對Williams 鑒別系統4 個鑒別寄主的抗感反應來確定其生理小種類型 （表1）。

2 結果與分析

2.1 Williams 鑒別系統鑒定結果

從表2 可以看出，20 份大白菜根腫病菌菌源對Williams 鑒別系統的4 個鑒別寄主均有很強的致病力，除13 號菌源和17 號菌源為2 號生理小種外，其他18 份菌源均為4 號生理小種，說明4 號生理小種在參試根腫病菌菌源中數量最多、分布 廣泛。

表1 Williams 鑒別系統

表2 20 份大白菜根腫病菌菌源生理小種鑒定結果

2.2 抗根腫病大白菜品種對不同根腫病菌菌源的抗性表現

從表3 可以看出，4 個不同育種單位選育的抗根腫病大白菜品種對20 份根腫病菌菌源的抗性反應可以劃分為6 個類別。其中，SSSS 類型包括的菌源最多，共9 份，占參試菌源的45%；其次為TTST 類 型，4 份；PTST 類 型 為3 份，STSP 類 型為2 份，PPSS 類型和TTPT 類型均為1 份。以上結果說明由Williams 鑒別系統劃分為同一生理小種的根腫病菌菌源對于不同大白菜抗病品種的致病力表現并不一致，根據4 個抗根腫病大白菜品種的抗性鑒定結果可進一步將4 號生理小種劃分為6 個不同的致病類型：菌源6、8、9、10、12、14、15、16、19 號的致病力最強（SSSS 類型），致病力最弱的是4 號菌源（TTPT 類型）。由Williams 鑒別系統鑒定為2 號生理小種的菌源13 號和17 號對4 個抗根腫病大白菜品種的致病力表現亦不同，分別為TTST 類型和PTST 類型，而菌源13 號與4 號生理小種的菌源1、3、5 號對抗根腫病大白菜品種的表現型相同，菌源17 號與4 號生理小種的菌源2、7號的表現型相同。

表3 4 個抗根腫病大白菜品種對不同根腫病菌菌源的抗性鑒定結果

3 結論與討論

近年來十字花科根腫病的發生逐年嚴重，面積不斷擴大，選用優質高抗品種成為防治該病的最佳途徑。抗病育種的首要前提是弄清病原菌的生物學特性及致病性。國內使用Williams 鑒別系統已鑒定出的根腫病菌生理小種有2 號、4 號、7 號、10 號和11 號，其中以4 號居多。本試驗結果表明，不同的抗根腫病大白菜品種對來源不同的4 號生理小種表現出不同的抗性，說明Williams 鑒別系統中鑒別寄主品種過少難以精細區分根腫病菌菌源的差異，另一方面也可能是鑒定所用的根腫病菌菌源不是單孢系，而是兩個或多個生理小種的混合物，致病力不同的生理小種所占比例不同造成對寄主品種的致病性不同。

這種鑒定為同一生理小種但對不同大白菜品種抗性表現不同的情況在前期試驗中也多次出現，因此本次試驗增加4 個大白菜品種作為輔助鑒別寄主共同進行生理小種的鑒定工作。結果同為4 號生理小種的18 份根腫病菌菌源根據對4 個大白菜品種的不同抗感反應劃分成6 種致病力不同的類型，同為2 號生理小種的13 號和17 號菌源也被劃分成2種類型。這一方面表明參試的根腫病菌菌源中可能存在比4 號生理小種致病力更強的菌株，Williams鑒別系統已不能精確劃分，這與原玉香等（2017）的研究結果相似；另一方面，菌樣未進行單孢分離，可能是多個小種的混合體，這也造成生理小種劃分上的困難。本試驗中使用的大白菜品種是在以往多次試驗的基礎上篩選出來的，抗病基因分子標記鑒定也表明這4 個品種分別具有不同的抗根腫病基因（待發表），今后根腫病菌生理小種劃分試驗中可以考慮使用與抗根腫病基因分子標記鑒定結果相對應的高代自交系或DH 系，鑒定結果將更穩定、可靠，同時與快速簡便的單孢分離培養技術相結合，才能更好地劃分根腫病菌生理小種，為抗病育種提供良好的保證。