HMGB1 基因多態性與肺結核易感性的關系

袁樂永 柯尊瓊

1湖北醫藥學院基礎醫學院免疫教研室（湖北十堰442000）；2十堰市人民醫院藥學部（湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部）（湖北十堰442000）；3十堰市中西醫結合醫院（湖北十堰442000）

據WHO 報道［1］，2017年我國結核病年發病人數約為160 萬，位居全球第二位，其中死亡病例近5 萬。大多數結核分枝桿菌感染呈現潛伏結核感染狀態，僅約10%患者會發展為活動性結核病，以上提示機體遺傳因素與結核病易感性相關［2］。目前有大量研究［3-8］報道，天然抗性相關巨噬蛋白1（NRAMP1），維生素D 受體，細胞因子，TOLL 樣受體（TLR），P2X7 受體，非整合素分子（DC-SIGN）等基因多態性與結核病易感性有關。上述基因大多數參與了人體對結核感染的免疫相關作用。

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein，HMGB1）作為一種高度保守的核蛋白，它參與了機體多種病理生理過程。比如，HMGB1 可通過活化巨噬細胞釋放炎癥因子從而引起機體炎癥反應，也與機體免疫相關等［9-10］。目前國內外報道［11-13］了關于HMGB1 基因多態性與多種疾病的關聯性研究，比如肺癌、高血壓、代謝綜合征等。但目前關于HMGB1 基因多態性與肺結核的關系尚未見相關報道。本研究擬采用病例對照關聯研究，通過一代測序方法檢測肺結核患者外周血HMGB1 基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），以探討HMGB1 基因多態性與肺結核易感性的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象按照國家統一診斷標準［14］選取2018年1月至2019年1月就診于十堰市疾病預防控制中心278 例新發結核患者為研究對象，其中男188 例，女90 例，平均年齡（47.2 ± 21.8）歲，排除標準：肺炎、肺癌或其他非結核性肺部疾患等類似病癥患者，乙型肝炎、免疫缺陷病或者采用免疫抑制劑治療的患者等免疫力低下患者；對照組選自且同一地域門診健康體檢人員225 例，其中男150 例，女75 例，平均年齡（46.3 ± 20.5）歲，排除結核病史、結核病接觸史以及BCG 接種史，胸片有異常，PPD 試驗陽性等人群。所有受試者均無血緣關系，本研究征得所有受試者同意并簽署了書面知情同意書。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 外周血DNA 提取抽血前患者及家屬簽署知情同意書，填寫一般資料調查表，采集所有受試者EDTA 抗凝外周靜脈血2 mL，采用DNA 提取試劑盒提取樣本基因組DNA 并檢測樣品濃度及純度，-80 ℃保存備用。DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 HMGB1 基因SNPs 挑取通過生物信息數據庫以及以往報道的文獻等資料，本實驗最終挑取了HMGB1 基因3 個SNPs（rs1045411、rs2249825 和rs1412125）進行進一步探討。

1.4 HMGB1 基因多態性檢測

1.4.1 HMGB1 基因參考序列根據Genebank 中獲得的HMGB1 基因序列設計PCR 擴增引物，引物序列見表1，引物采用Oligo 7.0 軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HMGB1 基因多態性位點與引物設計Tab.1 Polymorphisms of HMGB1 gene and primer design

1.4.2 DNA 擴增反應條件以上述提取的DNA為模板，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase 試劑盒進行核酸擴增，該實驗擴增反應總體積為40 μL，其中Premix 20 μL、模板10 μL、上/下游引物1 μL，余下用滅菌水補足，均勻混勻，置于PCR 儀進行擴增反應。本實設定的反應程序為：98 ℃變性10 s，63 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，總共40 個循環。DNA 擴增試劑盒購自日本TAKARA 公司。

1.4.3 測序配制2%瓊脂糖凝膠，將PCR 擴增產物加入凝膠進行電泳，溴乙錠染色，紫外線分析凝膠成像系統下觀察電泳結果并拍照。將目標條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒將PCR 產物進行純化并采用ABI 3500DX 測序儀進行測序。

1.5 統計學方法Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗及基因型、等位基因和單體型分布頻率采用χ2檢驗并計算比值比（odds ratio，OR）和95%置信區間（confidence intervals，CI），P＞0.05 表示采樣符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。各SNPs 標記之間采用D'和R（相關系數）進行連鎖不平衡分析，D'若R2＞1/3，D'＞0.75 表示顯著相關（緊密連鎖）。和R（相關系數）表示每對SNPs 之間的連鎖不平衡程度。（即單體型頻率實際觀察值和預測值之間的差異，連鎖不平衡的相對大小，值從-1到1）不同等位重組載體的構建各緊密連鎖的SNPs 組成的單體型。以上數據分析采用SPSS 17.0 及SHEsis 在線統計軟件進行分析，P ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1 基因測序結果PCR 產物電泳后經純化后進行測序分析。本研究檢測到HMGB1 基因3 個SNPs 所有基因型，見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗本研究共納入研究對象503 例，Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗結果顯示rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位點均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P ＞0.05），說明納入的研究具有群體代表性。見表2。

2.3 HMGB1 基因等位基因、基因型與結核病的關系HMGB1 基因rs1045411 等位基因G 和A 在對照組分布頻率分別為80.44%和19.56%、在結核組分別為79.32%和20.68%；GG、GA、AA 基因型在對照組分布頻率分別為67.11%、26.67%、6.22%，在結核組分別為62.23%、34.17、3.60%，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。本實驗也發現結核組HMGB1 基因rs2249825 與rs1412125 位點的等位基因和各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表3。

圖1 HMGB1 基因3 個SNPs 位點的測序圖Fig.1 Gene sequencing analysis of three SNPs

表2 HMGB1 基因Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗Tab.2 Hardy-Weinberg genetic balance test for HMGB1 gene 例

2.4 HMGB1基因各遺傳模型與結核病的關系研究結果表明，在各遺傳模型下，結核組rs1045411位點各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統計學意義（χ2＝3.286、1.292、1.886，均P＞0.05）；rs2249825和rs1412125位點各基因型分布在結核組與對照組之間差異也無統計學意義，見表4。

2.5 SNPs 位點連鎖不平衡分析采用連鎖不平衡檢驗方法分析HMGB1 基因各多態性位點的連鎖情況。Haploview 4.0 軟件分析3 個位點的關聯性，rs1045411/rs2249825，rs1045411/rs1412125 和rs2249825/rs1412125 的D′值分別為0.87、1.00 和0.85，r2值分別為0.50、0.70 和0.34，見圖2。通過D′與r2值發現3 個多態性位點緊密連鎖。

2.6 單體型與結核病的關聯分析由于分析單體型與疾病之間的關系比單個SNP 位點分析更有意義，因此通過網址分析了4 個不同的單體型與結核病的關系（見表5）。結果發現ACC 單體型與結核病發生風險增加存在強關聯（P ＜0.01）；而其他單體型與結核病無明顯關聯性（P ＞0.05）。

3 討論

據世界衛生組織報道［1］，全球約1/3 的人口感染過結核分枝桿菌，但僅1/10 的感染者會進一步發展為結核病，以上提示個體差異可能與結核病易感性有關。近年來國內外也報道［3-8］了一些基因多態性與結核病易感性有關，比如NRAMP1、維生素D 受體、白介素和Toll 樣受體等基因。HMGB1作為一種晚期炎癥介質之一，它通過活化機體巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞而發揮促炎作用［9］。同時，HMGB1 可上調IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α 等促炎因子的表達。人體感染結核桿菌后，結核桿菌可激活機體免疫細胞如巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞等發揮免疫應答功能。機體對結核桿菌菌體成分及代謝產物的產生免疫損傷反應，這些免疫細胞發生損傷或壞死，進而產生大量的HMGB1［15］，HMGB1 可進一步加重機體炎癥反應，從而引起機體損傷。HMGB1 基因多態性可能會影響其表達，進而加重或減輕機體炎癥反應，但結核病易感性與HMGB1 基因多態性關系尚未見報道。

表3 HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位點多態性分析Tab.3 Polymorphisms analysis of rs1049269，rs1245560，rs1245561 and rs1245562 for HMGB1 gene 例

表4 不同遺傳模型下SNP 位點分析Tab.4 Analysis of SNP loci under different genetic models 例

本研究探討了HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 三個位點與肺結核易感性的關系。研究結果顯示，HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 SNPs 位點的等位基因和各基因型分布頻率與對照組比較，差異均無統計學意義（P ＞0.05），而結核組rs1045411、rs2249825 和rs1412125 組成的單體型ACC 的分布頻率與對照組比較，差異具有統計學意義（P ＜0.05），且可能與結核病易感性有關（P ＜0.01）。以上結果提示單體型ACC 可能會增加HMGB1 蛋白表達水平，HMGB1 水平增加會誘導巨噬細胞和淋巴細胞等免疫細胞釋放大量炎癥因子，從而促進結核病的進展。

表5 HMGB1 基因單體型分析Tab.5 Haplotype analysis for HMGB1 gene

圖2 IRGM SNPs 位點間的連鎖不平衡分析圖（D′和r2值）Fig.2 Analysis diagram of linkage disequilibrium between IRGM SNPs sites（D′and r2 values）

綜上所述，檢測HMGB1 基因SNPs 位點對于篩選結核病易感人群有一定臨床價值，對于攜帶上述結核易感基因的結核患者進行早期預防以及早期診斷和治療具有重要的意義。本次實驗雖然在湖北人群中揭示了HMGB1 基因多態性與結核病易感性關系，但該基因的多態性可能與結核病發病風險之間存在遺傳異質性，不同的國家、不同的種族、同一國家不同地區、甚至同一地區不同環境HMGB1 基因多態性分布類型可能不同，因此本地區HMGB1 基因的多態性與結核的易感性相關尚不能斷定該基因是結核的易感基因。有待于進一步研究和探索。