不同濃度硒對煙草根系形態、生長素含量及相關基因表達的影響

羅 勇，劉勝波，張 濤，王立志，軒棟棟，徐滌寒，邵惠芳，賈宏昉*

1. 河南農業大學煙草學院，鄭州市文化路95 號450002

2. 史丹利化肥寧陵有限公司，河南省商丘市寧陵縣露嶺路 476000

3. 浙江中煙工業有限責任公司，杭州市上城區中山南路77 號 310000

硒是一種重要的營養元素。大量研究表明硒對植物生長具有雙重效應，適量的硒可以增強抗氧化能力，延緩衰老，促進植物生長［1-2］。一般認為，硒在低濃度(0.001～0.05 mg/kg)時對植物的生長發育有促進效應，高濃度則起到抑制作用，甚至產生毒害［3］。Han 等［4］報道，低濃度硒（2.2 mg/kg）可促進煙草生長，根系生物量提高10.3%；高濃度硒（11.1 mg/kg）則抑制植物生長，根系生物量僅為對照處理的70.5%。高家合等［5］研究表明，施用適量硒不僅能提高根系活力，促進煙草生長, 還提高了煙葉品質和卷煙的安全性。賈宏昉［6］研究提出，葉片噴施適量的硒可顯著增加烤煙全氮含量、降低總糖含量，有利于改善烤煙品質。王美珠等［7］發現煙葉硒含量的增加可導致卷煙焦油量和自由基濃度降低, 使人體的血硒水平通過抽吸富硒卷煙而得到提高。可見，葉片噴施適量硒可提高烤煙的產量、品質以及安全性。硒對植物的生長發育的作用機制研究主要集中在抗氧化作用上，而對激素在這個過程中所起的作用研究較少。生長素是調節植物根系發育的一種關鍵激素，參與脅迫反應中根系構型的變化［8-10］，從而有助于植物體從地下吸收營養物質到莖稈部，促進植物的生長發育［11］。Lehotai等［12］報道，施用高濃度Se（40 μmol/L）可抑制擬南芥主根伸長并降低生物量。進一步的研究表明，高濃度硒可以降低根尖生長素濃度，但低濃度硒是否可以通過改變生長素含量而促進植物生長發育尚鮮見報道。因此，以能標記生長素的DR5::GUS 云煙87 轉基因煙草為材料，研究不同濃度硒處理對煙草生物學性狀、生長素、MDA 含量及NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表達的影響，揭示不同濃度硒對煙草生長發育的作用，旨在為富硒煙草栽培技術和煙葉的綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2017—2018 年在河南農業大學文化路校區實驗室的人工培養箱內進行，光強300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 晝，24 ℃/8 h 夜。供試材料為DR5::GUS 云煙87 轉基因純合株系（該轉基因材料僅用于室內試驗，以便于標記生長素），DR5 是一個人工合成的響應生長素的啟動子。挑選飽滿光潔無菌斑的種子經過75%的酒精消毒30 s，10%次氯酸鈉消毒7 min,滅菌蒸餾水沖洗5 次，放在MS培養基上育苗，并放入28 ℃暗室培養3 d 催芽。催芽后的種子放入光照培養箱培養1 周，選取長勢較為一致的幼苗移至MS 培養基的組培瓶中，進行21 d 的營養處理。硒以Na2SeO3加入配置的MS培養基中，硒濃度為0、1、5、10 和20 mg/L，分別以Se0、Se1、Se5、Se10、Se20 表示。每處理設置3 次重復，每重復10 株煙苗。

1.2 樣品采集與分析

根系形態的測定：每重復取3株長勢一致的煙苗（處理21 d），用去離子水沖洗根系，拍照，再用根系掃描儀［型號：Expression 11000xl，愛普生（中國）有限公司］測定不定根長度，人工測定二級根長度和數量。

生物量的測定：每重復取3 株長勢一致的煙苗（處理21 d），分地上部和地下部用天平（感量0.001 g）稱量，并記錄樣品鮮質量。

生長素的測定：每重復取3 株長勢一致的煙苗（處理21 d），分地上部和地下部，鮮樣于-70 ℃冷凍保存。采用酶聯免疫法(ELISA)［13］測定煙株中生長素含量（質量分數）。IAA 標準品購自Sigma-Aldrich 公司。

NBT 染色與MDA 含量的測定：每重復取5 株長勢一致的煙苗（處理7 d），用清水沖洗干凈，浸沒于NBT 染液中，30 ℃染色5 h。待染色完成后將葉片分別放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脫色完全，用Olympus SZX16 體式顯微鏡（日本奧林巴斯公司）觀察并照相。參照Feng 等［14］的方法測定MDA 含量（質量分數）。

GUS 組織染色和活性測定：每重復取5 株長勢一致的煙苗（處理21 d），將煙苗整株浸沒于GUS染液中，37 ℃染色24 h。待染色完成后將煙苗分別放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脫色完全，在OlympusSZX16 體式顯微鏡下觀察并拍照。參照李依婷［15］的方法進行GUS 活性測定。使用牛血清白蛋白作為標準物，用Bio-Rad 蛋白質測定試劑盒（美國伯樂公司）測定蛋白質含量（質量分數）。

NtYUCCA 和NtPINs 基因家族的表達：煙苗處理21 d 后，對0、1 和10 mg/L 硒處理的煙苗整株取樣（每重復分別取10 株長勢一致的煙苗），參照王立志等［16］的方法進行qRT-PCR 分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，新復極差法進行差異的顯著性比較。采用Olympus SZX16體式顯微鏡、Adobe Photoshop 和Microsoft Excel 2010 軟件分別進行染色拍照、圖像處理和圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同濃度硒處理煙草表型及生物量的變化

與對照（Se0）相比(圖1A)，低濃度硒（Se1）處理煙苗根系發育較好，主根明顯伸長，高濃度硒（Se5、Se10、Se20）處理植株矮小，葉片小而少。與對照（Se0）相比（圖1B、C），煙苗地上部和地下部（根系）生物量分別顯著增加76.9%和105.9%；高濃度硒處理（Se5、Se10、Se20）的煙苗地上部與地下部生物量與對照相比，分別顯著減少36.9%、60.8%、70.8%和39.8%、64.0%、73.8%。適宜的硒濃度顯著增加煙苗主根根長和側根數，特別是Se1 處理，主根根長和側根數分別是對照（Se0）的2.1 倍和2.0 倍（圖1D、E）。表明硒處理可以改變煙苗的根系結構，低濃度硒（1 mg/L）能夠促進煙苗根系的生長發育，高濃度硒（5、10、20 mg/L）則起到抑制作用。

2.2 不同濃度硒處理對煙草生長素含量的影響

5 個處理煙苗地上部和地下部生長素含量見圖2。與對照（Se0）相比，低濃度硒處理的煙苗（Se1）地上部生長素含量增加13.6%，地下部生長素含量增加37.1%；高濃度硒處理（Se5、Se10、Se20）的煙苗地上部和地下部生長素含量均顯著降低，其中煙苗地上部含量分別降低4.3%、32.6%和55.4%，而煙苗地下部生長素含量分別降低10.7%、21.7%和34.2%。煙苗地上部和地下部生長素含量隨著硒用量的增加而降低。

2.3 不同濃度硒處理對煙草抗氧化能力的影響

膜脂過氧化產物MDA 含量見圖3。與對照（Se0）相比（圖3A），低濃度硒處理（Se1）的煙苗新葉顏色較淺，說明活性氧量較少，抗氧化能力強，高濃度硒處理（Se10）的新葉顏色深，活性氧量較多，抗氧化能力弱。與對照相比（圖3B），低濃度硒處理（Se1）的煙苗MDA 含量下降39.8%，高濃度硒處理（Se10）MDA 含量則上升44.4%。說明低濃度硒處理有利于降低MDA 含量，緩解氧化脅迫，對煙草細胞膜有一定保護作用，高濃度硒則促進MDA 的生成，加劇氧化脅迫，進而促進了細胞膜脂質過氧化。

圖1 不同濃度硒處理煙苗生物量統計及根系表型比較Fig.1 Biomass statistics and root phenotype of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖2 不同濃度硒處理煙苗生長素含量比較Fig.2 Auxin contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖3 不同濃度硒處理煙苗葉色及MDA 含量比較Fig.3 MDA contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

2.4 不同濃度硒處理對煙草生長素分布的影響

煙苗中DR5::GUS 的染色情況和GUS 活性見圖4。與對照（Se0）相比（圖4A），低濃度硒處理（Se1）煙苗新葉、側根根原基和距根尖1～2 cm 處的DR5::GUS 顏色較深，煙苗生長素在根系分布較多；高濃度硒處理（Se10）則顏色較淺，煙苗生長素在根系分布較少；與對照(Se0)相比（圖4B、C），低濃度硒處理（Se1）的煙苗地上部和地下部GUS 活性分別提高34.1%和40.1%，高濃度硒處理（Se10）的煙苗地上部和地下部GUS 活性則分別下降65.5%和67.6%。這表明低濃度硒處理DR5 啟動子表達水平增強，高濃度硒則會抑制啟動子表達，這與染色的結果一致。

2.5 不同濃度硒處理對煙草根系中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表達的影響

煙苗根系中NtYUCCA 基因家族和生長素極性運輸蛋白NtPINs 基因家族的表達見圖5。除NtYUCCA3、NtYUCCA10 和NtPIN2、NtPIN3、NtPIN11的表達水平較低沒有統計學意義外，低濃度硒處理（Se1）的 煙 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表達水平分別增加87.2% 、521.3% 、725.2% 和248.3% ，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 的基因表達水平分別增加91.1%、186.1%、35.4%和28.5%。高濃度硒處理（Se10）的 煙 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表達水平分別降低62.8%、22.7%、47.9%和16.8%，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 基因表達水平分別降低44.9%、22.8%、12.8%和14.7%。這表明低濃度硒處理可促進生長素合成和極性運輸，高濃度硒處理則起到抑制作用。

圖4 不同濃度硒處理煙苗各部位生長素分布和GUS活性比較Fig.4 Auxin distribution and GUS activity in different parts of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖5 不同濃度硒處理煙苗中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族相對表達量比較Fig.5 Relative expressions of NtYUCCA and NtPINs gene families in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

3 討論

植物根系形態對植物體從土壤中吸收養分有較大影響［17］。在本試驗中，低濃度硒（1 mg/L）處理可顯著促進煙株生長，高濃度硒(10 mg/L)處理則對煙株生長發育產生抑制作用。這與Ramos 等［18］在生菜上和Yao 等［19］在小麥上的試驗結果一致。付冬冬等［20］在對不同硒處理的小白菜研究中提出，低濃度硒處理可促進小白菜的生長,而高濃度硒處理則起到抑制作用。但本試驗結果與Lyons 等［21］和周鑫斌等［22］的研究結果存在差異。Lyons 等［21］認為低濃度亞硒酸鹽對小麥的生長雖有促進作用，但效果沒有達到顯著水平；周鑫斌等［22］提出8 mg/L 以下的亞硒酸鹽濃度不會顯著提高水稻的生物量。可能是因為不同作物類型對硒的吸收與品種、pH、離子環境等因素有關，其有效濃度可能存在較大差異［23］，但總體趨勢為低濃度硒處理表現為促進作用，高濃度硒處理則表現為抑制作用。

本試驗中，低濃度硒處理煙株活性氧量減少，MDA 含量降低，而高濃度硒處理則活性氧量增加，MDA 含量提高。Cartes 等［24］研究提出，當加入的硒濃度≥6.0 mg/kg 時，黑麥草中MDA 含量增加，反之則減少。Feng 等［25］研究表明，當硒濃度≤2.0 mg/L 時，蜈蚣草中MDA 含量減少，反之則增加。MDA 是植物在逆境條件下的膜脂過氧化反應產物之一，能直接反映膜受損和膜脂過氧化程度。植物在發生硒毒害的情況下，對營養元素的吸收會減少［26］，植物體內Ca 可以抵抗逆境帶來的損傷，參與多種酶活性的調節［27］，保護細胞膜的完整性［28］。有研究表明，低濃度硒（2.2 mg/L）處理可以促使烤煙對Ca 元素的吸收，高濃度硒(22.2 mg/kg）處理烤煙各部位鈣含量均低于低濃度硒處理［29］。Mg 也有與Ca 相似的功能［30］。由此推測，煙株對Ca 和Mg 等元素的吸收，可能抑制了高濃度硒的毒害作用，其作用機制還有待進一步深入研究。

生長素參與植物生長發育的調控［31-32］。在本試驗中，利用DR5::GUS 轉基因材料GUS 報告基因表達與生長素分布積累部位一致的特性［33-35］，可直觀描述不同濃度硒處理對煙草生長素分布的影響。前人研究表明，磷參與調節植物體內的生長素合成和極性運輸，從而影響根系的構型［36］。缺磷可增加根系生長素含量，促進根系生長，提高根冠比［37］。最新研究發現，亞硒酸鹽和磷酸鹽具有相似的吸收機制，磷轉運蛋白OsPT8 參與植物對亞硒酸鹽的吸收［38］，推測硒可能通過與磷互作從而改變生長素的濃度來影響植物生長和發育。而有關硒和磷互作條件下添加外源生長素對煙苗生長發育的影響，以及磷硒互作對煙草生長發育的作用機制尚需進一步試驗。

不僅生長素，其他內源激素（細胞分裂素、乙烯、赤霉素）等對植物根系發育也可能有一定影響。有研究表明，高濃度硒處理通過活性氧的積累、植物激素的變化等復雜組合方式而抑制根系生長［39］。Lehotai 等［12］利用擬南芥研究了亞硒酸鹽誘導的應激過程中激素（生長素、細胞分裂素、乙烯）和信號組分（NO 和H2O2）間可能的作用和關系。提出高濃度亞硒酸鹽誘導的乙烯生物合成增強可能導致植株細胞死亡，引起植物生長障礙；同時，較高Se 濃度（20、40 μmol/L）處理可抑制蛋白質的合成，增加活性氧的積累，影響植物根系的發育。因此，不同濃度硒處理下細胞分裂素、乙烯、赤霉素等激素在煙株根系發育過程中的作用及機制還需要進一步深入研究。

4 結論

在人工培養箱（光強300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 晝，24 ℃/8 h 夜）中，通過改變培養基硒濃度（0、1、5、10 和20 mg/L）研究了煙草幼苗對不同濃度硒處理的響應。硒對煙草的生長發育具有雙重效應。低濃度硒（1 mg/L）處理條件下, 生長素合成NtYUCCA 基因家族與生長素極性運輸蛋白NtPINs 基因家族的表達水平提高，生長素的合成以及地上部向根部的極性運輸明顯增加，根系生長素含量提高，從而促進煙草生物量顯著增加，并改變了煙草根系構型（主根伸長，側根數量多），MDA 含量降低，抗氧化能力增強，促進了煙草的生長發育；高濃度硒（10 mg/L）處理條件下，生長素合成以及地上部向根部的極性運輸被抑制，生長素含量降低，煙草的生長發育受到抑制。