不同種屬來源活化體系中CYP2A6 酶活及其對煙堿代謝的動力學

王蕙婷，李 翔，華辰鳳，許良濤，趙 閣，尚平平，喬梁峻，趙俊偉，劉惠民，彭桂新，謝復煒*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市經濟技術開發區第三大街8 號 450000

CYP2A6 作為細胞色素P450 酶家族中的一員，主要表達于肝臟，約占細胞色素P450 的5%，主要參與煙堿及臨床上常用的藥物如甲硝唑、替加氟等的代謝［1-2］，也在煙草特有亞硝胺NNK 和NNN 的代謝活化中起至關重要的作用［3］。煙堿是卷煙煙氣中的重要活性成分，燃吸煙草時釋放出的煙堿可使吸煙者的植物神經和中樞神經系統受到刺激，吸煙者通過攝入煙堿來維持血、腦中的煙堿水平，形成吸煙依賴行為［4-6］，因此，煙堿是煙草依賴形成和維持的主要驅動力。研究表明，人體內約70%～80%的煙堿通過CYP2A6 催化的反應被代謝成可替寧［7］（圖1）。首先，CYP2A6 介導煙堿C-氧化為煙堿△1′（5′）-亞銨離子，再經細胞質醛氧化酶氧化成可替寧，可替寧再由CYP2A6 進一步催化形成反式-3′-羥基可替寧、5′-羥基可替寧和去甲可替寧。上述代謝途徑表明，CYP2A6 是煙堿的主要代謝酶。研究發現，CYP2A6 活性在不同個體之間存在較大差異［8］，且與正常吸煙者相比，CYP2A6 活性較低的吸煙者每天消費卷煙數量更少，體內較高的CYP2A6 酶活會使吸煙者消費卷煙量變大，暴露于更高濃度的致癌物中，從而導致肺癌風險增高［9-10］。因此該酶活性水平直接影響體內煙堿代謝速率及個體吸煙行為，從而導致暴露風險變化［11-12］。

不同種屬間的藥物代謝差異一直是藥物研發的重點。有研究報道，不同種屬對香豆素的代謝能力不同，表明CYP2A6 在種屬間的表達存在顯著差異［13-14］，且CYP2A6 酶的基因是高度多態性的，迄今為止已經發現了40 多種變異，不同基因型的CYP2A6 酶活存在著明顯差異［15-17］，這些差異均可導致研究結果不同。目前國內外關于CYP2A6 酶活的報道主要集中于不同人群的CYP2A6 遺傳表型及其與吸煙行為、相關癌癥發病率的相關性研究［18-20］，關于該酶在體外藥物代謝模型應用方面的研究較少。有研究人員使用不同動物的肝微粒體或同源重組人工酶進行體外藥物代謝研究［21-22］，但不同種屬間CYP2A6 酶蛋白表達水平及酶活性差異尚不明確。所以，在體外條件下探究不同來源活化體系中的CYP2A6 酶活對卷煙煙氣的體外毒理學研究具有重要意義。因此，本研究中選取CYP2A6 重組酶、不同來源的人肝微粒體及藥代動力學實驗中常用的動物肝微粒體等進行CYP2A6 酶體外活性研究，以期為煙堿的體外毒理學評價提供數據支撐。

圖1 煙堿主要代謝通路：由CYP2A6 及醛氧化酶依次催化成可替寧Fig.1 Metabolic pathway for nicotine catalyzed by CYP2A6 and aldehyde oxidase successively to cotinine

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

支氣管上皮細胞BEAS-2B 細胞、巨噬細胞、HepG2 細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；CYP2A6 重組酶（EZ011）（0.5 mL，10 mg/mL）、無表達對照蛋白（EZ003）（0.5 mL，10 mg/mL）（英國Cypex 公司）；25 供體混合性別人肝微粒體（X008064）（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性SD大鼠（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性恒河猴（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性比格犬（混合）肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、雄性SD 大鼠（混合）肝S9（0.5 mL，20 mg/mL）（美國BioIVT 公司）；男性混合人肝微粒體（0.5 mL，20 mg/mL）、NADPH 發生系統（匯智泰康生物技術有限公司）。

支氣管上皮細胞基礎培養基（Bronchial epithelial cell basal medium，BEBM）、SingleQuots 細胞因子（CC-3171，Clonetics）（美國Lonza 公司）；改良Eagle 培養基（Dulbecco's modified of eagle's medium，DMEM）、胎牛血清、青鏈霉素混合液（生化級，美國Gibco 公司）；胰酶（500 U/mg，美國Amresco 公司）；甲酸銨（色譜純，上海安譜實驗技術股份有限公司）；煙堿、煙堿-d3（NIC-d3）（色譜純，加拿大TRC 試劑公司）；氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉（AR，天津凱通化學試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，生化級，美國Amresco 公司）；乙腈（色譜純，美國J&T Baker 公司）；蛋白分子量標準品（26617，美國Thermo Scientific 公司）；兔抗一抗β-actin（ab8227）、兔抗一抗 GADPH（ab181602）、兔 抗 一 抗 CYP2A6（ab3570）（英國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔二抗、增強化學發光法（Enhanced chemiluminescence，ECL）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；哺乳動物蛋白提取試劑（Mammalian protein extraction reagent，78501，美國Thermo 公司）。

HERA Cell 240 細胞培養箱（美國Thermo 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺（江蘇省蘇州安泰空氣技術有限公司）；細胞培養皿（430166，美國Corning 公司）；TH4-200 顯微鏡（日本Olympus 公司）；Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美 國Merck Millipore 公司）；AL204-IC 電子天平（感量0.000 1 g，瑞 士Mettler Toledo 公 司）；Mini Trans-Blot Electrophoreti 蛋白免疫印跡小型Trans-Blot 轉印槽（美國Bio-Rad 公司）；Fluor Chem E 超靈敏全自動成像分析系統（美國Protein Simple 公司）；3-18K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；13 mm×0.22 μm有機相針式濾膜（上海安譜科學儀器有限公司）；Milli-Q 超純水純化系統（美國Millipore 公司）；1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；API 4000 液相色譜/質譜（HPLC/MS）聯用儀（美國AB SCIEX 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

1.2.1.1 貼壁生長細胞培養

將BEAS-2B 細胞接種于含有BEBM 細胞培養基（加SingleQuots 細胞因子）的10 cm 培養皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。觀察細胞生長狀況，在細胞生長匯合度達到80%后，用0.05%（體積百分比）胰酶消化，離心，棄去上清液；加入新鮮培養基，制成細胞懸液，并進行細胞培養。

HepG2 細胞所用培養基為含有10%（體積百分比）胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養基，0.25%（體積百分比）胰酶消化，培養方法同上。

1.2.1.2 懸浮生長細胞培養

將巨噬細胞接種于含有10%（體積百分比）胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養基的培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養。觀察細胞生長狀況，在細胞生長至對數生長期時，離心，棄上清液，加入新鮮的培養基制成細胞懸液，傳代并進行細胞培養。

1.2.2 免疫印跡法測定各體系中CYP2A6 蛋白表達水平

采用1.2.1 節所述方法對細胞進行培養，收獲細胞于冰上裂解得到細胞全蛋白，肝微粒體及重組酶可解凍后直接進行實驗。使用紫外分光光度計測量全蛋白濃度，調整電泳上樣量均為20 μg 蛋白。制備5%（質量分數）的濃縮膠和8%～15%（質量分數）的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離膠并對蛋白樣品進行分離。使用轉膜裝置將蛋白質轉印至PVDF 膜上（轉膜電壓100 V，轉膜時間1 h）。將PVDF 膜于5%的脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，使用含Tween 20（0.05%）的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline and Tween 20，TBST）洗膜3 次，每次5 min，后與相對應的兔抗一抗于4 ℃下孵育過夜。次日使用TBST 洗膜3 次，每次5 min，后與HRP 標記的山羊抗兔二抗于室溫中孵育1 h。使用TBST 洗膜3 次，每次5 min。然后使用ECL 進行顯影，使用顯影儀拍照。

1.2.3 煙堿代謝孵育方法

用KH2PO4緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）將各體系蛋白液稀釋至一定濃度，各反應體系為0.2 mL。根據實驗設定精密量取煙堿標準品溶液加入反應體系中，37 ℃預孵育5 min 后，立即加入NADPH 發生系統啟動反應。反應一定時間后，加入等體積含內標的乙腈終止反應，然后將孵育液渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾，進行HPLC-MS/MS 分析。以無表達對照蛋白組的孵育體系為陰性對照。進行3 次重復實驗。

1.2.3.1 煙堿在各體系中的穩定代謝

孵育體系為0.2 mL，包含KH2PO4緩沖液、各活化體系（蛋白濃度0.5 g/L）、煙堿（200 ng/mL），37 ℃水浴中預孵育5 min 后，加入同法預孵的NADPH 溶液啟動反應，繼續于37 ℃水浴中孵育，并分別于0、5、10、15、30、45、60 min 取出，立即加入等體積含內標的乙腈溶液終止反應。將孵育液渦旋3 min，13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾，進樣檢測剩余煙堿的濃度。

1.2.3.2 目標代謝體系對煙堿的代謝動力學參數分析

A. 不同蛋白濃度下煙堿的代謝-時間曲線

根據穩定性代謝實驗結果確定目標體系，將CYP2A6 重組酶代謝活化體系的蛋白終濃度調節為系列濃度（0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL），將雄性恒河猴（混合）肝微粒體及25 供體混合性別人肝微粒體代謝活化體系的蛋白終濃度均調節為系列濃度（0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mg/mL）。孵育體系中煙堿初始濃度為8 μg/mL。在37 ℃預孵育5 min 后，立即加入NADPH 溶液啟動反應，每個濃度樣品分別在孵育0、5、10、20、30、60、120 min 后用等體積含內標的乙腈終止反應，每個蛋白濃度及時間點平行操作3 管。對樣品處理后進行HPLC-MS/MS 分析。以孵育后的底物濃度對孵育時間作圖。

B. 酶動力學參數的測定

根據1.2.3.2 節A 項下方法所得結果，確定線性范圍內的孵育時間點和蛋白濃度點，在此條件下測定酶動力學參數。在最佳蛋白濃度下的各體系中，分別加入不同濃度的煙堿，使其在孵育體系中的初始濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/mL，37 ℃預孵育5 min，加入NADPH 啟動反應，37 ℃孵育至最佳孵育時間后，加入等體積含內標的乙腈終止反應，13 000 r/min 離心20 min，取上清液過濾后進行HPLC-MS/MS 分析，測定剩余煙堿的濃度，每個底物濃度平行操作3 管，按照Lineweaver Burk法計算米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）［23］。

1.2.4 HPLC-MS/MS 檢測方法

將得到的樣品用濾膜過濾處理后進行HPLC-MS/MS 分析，分析條件：

色譜柱：Waters×Bridge C18柱（2.1 mm×150 mm，5.0 μm）；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.30 mL/min；流動相：A 水（10 mmol/L 甲酸銨，用甲酸調節pH=3.0），B 乙腈，梯度洗脫（0～11 min，5%～70% A；11～13 min，70%～5% A；13～16 min，5% A）；進樣前，色譜柱平衡16 min。離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣（CAD，N2）：41.37 kPa（6 psi）；霧化氣（GS1，N2）：344.75 kPa（50 psi）；輔助加熱氣（GS2，N2）：344.75 kPa（50 psi）；氣 簾 氣（CUR，N2）：68.95 kPa（10 psi）；電噴霧電壓：5 000 V；干燥溫度：500 ℃；掃描時間：40 ms；檢測模式：多反應監測（MRM）模式。

1.2.5 數據統計分析

實驗結果重復3 次，數據以平均值±標準偏差表 征。 采 用Graphpad Prism 5.0 軟 件（美 國GraphPad 軟件有限公司）進行酶動力學參數分析。使用SPSS 13.0 軟件（美國SPSS 公司）對數據組間差異進行統計分析，使用單因素方差分析法（One-way analysis of variance，ANOVA）對數據進行最小顯著差異（Least significant difference，LSD）檢驗。P＜0.05 時差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 各體系中CYP2A6 蛋白表達水平

采用免疫印跡法檢測相同蛋白上樣量（20 μg）中各活化體系中CYP2A6 蛋白表達水平，結果如圖2 所示，由HepG2 細胞、BEAS-2B 細胞和巨噬細胞（1、2 和3）中內參蛋白β-actin 與GADPH 的表達水平基本一致可判斷免疫印跡實驗中每組樣品蛋白上樣量一致。β-Actin 及GAPDH 廣泛表達于細胞漿中［24-25］，而重組酶在大腸桿菌中表達提取，故4 號體系中無內參蛋白表達。肝S9 由肝組織勻漿取上清液后制得，主要成分為微粒體和胞質組分，肝微粒體只含有內質網亞細胞組分［26］，二者的制備過程均發生內參蛋白量的改變。所以內參蛋白β-actin 與GADPH 的表達水平在各體系中存在差異。因此，本研究中采用分光光度計調整各體系蛋白上樣量均為20 μg，進行3 次獨立實驗。由圖2 可知，與陰性對照組相比，CYP2A6 重組酶（以下簡稱重組酶）中CYP2A6 蛋白表達水平較高，25供體混合性別人肝微粒體（以下簡稱25 供體人肝微粒體）及男性混合人肝微粒中均有少量表達。由于該酶主要在肝臟表達，在呼吸系統及免疫系統表達較少且存在較大的個體差異性［27-31］，故在BEAS-2B 細胞和巨噬細胞中均未檢測到CYP2A6蛋白。而HepG2 細胞屬于肝腫瘤細胞，其藥物代謝酶活性遠遠低于正常肝細胞［32］，因而在HepG2細胞中也未檢測到CYP2A6 蛋白。由于種屬差異，CYP2A6 酶在猴肝部的表達水平較高，而在犬肝部幾乎不表達［33］，故本實驗中雄性恒河猴（混合）肝微粒體（以下簡稱猴肝微粒體）中CYP2A6蛋白表達水平明顯高于雄性比格犬（混合）肝微粒體（以下簡稱犬肝微粒體）。關于CYP2A6 酶在大鼠體內的表達，有報道證明大鼠肝微粒體內含有CYP2A6 酶［34］，也有研究認為CYP2A6 酶于大鼠肝微粒體幾乎不表達［33］，故于雄性SD 大鼠（混合）肝微粒體（以下簡稱大鼠肝微粒體）檢測到少量的CYP2A6 蛋白，而不同來源的雄性SD 大鼠（混合）肝S9（以下簡稱大鼠肝S9）中則未檢測到該蛋白。免疫印跡法測得的結果反映了各體系中CYP2A6 蛋白表達水平的高低，而各體系中CYP2A6 實際酶活性高低還需后續的代謝動力學實驗進行測定。

圖2 免疫印跡法測定各體系中的CYP2A6 蛋白表達水平Fig.2 Determination of CYP2A6 protein expression levels by immunoblotting

2.2 煙堿在各體系中的代謝穩定性

為了比較各活化體系對煙堿代謝能力的差異，分別在各體系中進行低濃度煙堿穩定代謝實驗。結果表明不同體系對煙堿的代謝能力不同。從煙堿的穩定代謝曲線（圖3a）可知，在各體系（蛋白濃度均為0.5 mg/mL）中，煙堿在30 min 內代謝較快，30～60 min 內剩余底物的濃度變化較小，趨于穩定。通過各體系在孵育2 h 后的煙堿代謝率（圖3b），可更為直觀地比較各體系對煙堿代謝能力的差異，且結合2.1 節結果發現，各體系煙堿代謝率與其CYP2A6 蛋白表達水平基本一致，其中，HepG2、BEAS-2B 及巨噬細胞中CYP2A6 蛋白表達水平及煙堿代謝能力最低，重組酶及猴肝微粒體中的CYP2A6 蛋白表達水平最高，對煙堿代謝能力最強。在CYP2A6 蛋白表達水平均較低的情況下，25 供體人肝微粒體的煙堿代謝能力明顯高于男性混合肝微粒體及其他CYP2A6 蛋白表達水平相近的體系；免疫印跡結果表明，大鼠肝S9 中CYP2A6 表達水平明顯低于大鼠肝微粒體及犬肝微粒體，但三者CYP2A6 酶中煙堿代謝率均約為10%。這些差異表明，除酶蛋白表達水平外，種屬、性別及基因型的不同對代謝能力也存在顯著影響［14,16,35］。通過比較CYP2A6 蛋白表達水平及其對煙堿代謝率發現，各體系中CYP2A6 酶活存在顯著差異。CYP2A6 酶活高低對于卷煙煙氣的其他成分的代謝活化過程是否有影響還需要進一步討論。

圖3 不同體系對煙堿代謝能力的比較Fig.3 Metabolic activity of nicotine in different systems

2.3 目標代謝體系對煙堿的代謝-時間曲線

按照1.2.3.2 節A 項下的方法測得數據，為進一步探究各體系實際酶活性，將煙堿代謝率最高的3 個體系（CYP2A6 重組酶、猴肝微粒體及25 供體人肝微粒體）作為目標體系進行代謝動力學參數的測定。以不同孵育時間對目標體系中剩余煙堿濃度繪制不同蛋白濃度下的孵育時間曲線（圖4）。由不同蛋白濃度下重組酶代謝-時間曲線（圖4a）可知，當重組酶蛋白濃度為0.5 mg/mL 時，孵育10 min 內有良好線性。表明在測定CYP2A6 重組酶的代謝動力學參數時，應使用0.5 mg/mL 的蛋白濃度，與煙堿共孵育10 min。由25 供體人肝微粒體的代謝-時間曲線（圖4b）分析可知，在孵育時間10 min 內，1.0 mg/mL 及1.5 mg/mL 蛋白濃度下的孵育時間曲線較為接近，且均具有良好的線性，在滿足代謝現象明顯且盡量降低體系蛋白濃度的原則下，25 供體人肝微粒體的最佳孵育條件為蛋白濃度1.0 mg/mL，孵育10 min。基于此原則分析猴肝微粒體（圖4c）的代謝-時間曲線，可得其孵育條件應設置為蛋白濃度1.0 mg/mL、孵育10 min。

圖4 不同蛋白濃度下各目標體系的煙堿代謝-時間曲線Fig.4 Metabolic-time curves of nicotine in target systems at different protein concentrations

2.4 目標代謝體系對煙堿代謝的動力學參數

因動力學參數的測定需要確定該體系對底物的最佳孵育時間及酶濃度，即其代謝-時間曲線在線性范圍內的孵育時間及蛋白濃度，從而在此條件下進行酶動力學參數的測定。故由2.3 節的代謝-時間曲線可得，重組酶、25 供體人肝微粒體及猴肝微粒體的最佳線性孵育蛋白濃度分別為0.5、1.0、1.0 mg/mL，最佳線性孵育時間均為10 min。在此條件下測定系列煙堿濃度下的煙堿代謝速度，并以煙堿代謝速度與其初濃度做濃度孵育曲線（圖5）。計算的3 個體系的Km值和Vmax值結果如表1 所示。

代謝動力學參數表明，重組酶及猴肝微粒體中CYP2A6 酶的Km及Vmax值較為接近，25 供體人肝微粒體中CYP2A6 酶Km及Vmax值較低。較低的Km值表明該CYP2A6 酶對煙堿代謝親和力強。結合免疫印跡實驗結果分析，重組酶及猴肝微粒體中CYP2A6 酶Vmax值基本與其酶蛋白表達水平正相關。而在25 供體人肝微粒體中，CYP2A6 蛋白表達水平較低，但Vmax值與CYP2A6 重組酶及猴肝微粒體較為接近，該結果表明25 供體人肝微粒體中CYP2A6 的酶活顯著高于CYP2A6 重組酶及猴肝微粒體。這種酶活性的差異與其種屬有關［14］。綜合比較各目標體系，25 供體人肝微粒體及猴肝微粒體不僅對煙堿代謝活性較高，且均富含大量的P450 酶及其他代謝酶［36-39］，在體外藥物代謝研究領域中應用范圍較廣。而同源重組CYP2A6 酶的活性最高，在煙堿的體外代謝研究及煙氣的體外毒性評價中具有較強的適用性。但與肝微粒體體系相比，酶種類單一，且代謝機制仍需進一步探索研究。

圖5 線性條件下各目標體系的煙堿濃度-孵育曲線Fig.5 Incubation curves of nicotine in target systems under optimum linear conditions

表1 各體系代謝動力學參數Tab.1 Metabolic kinetic parameters of target systems

3 結論

①10 種活化體系中CYP2A6 酶活具有明顯差異，煙堿在與25 供體混合性別人肝微粒體、同源重組CYP2A6 酶及雄性恒河猴肝微粒體共孵育時其濃度明顯降低，而另外7 種則無CYP2A6 活性或活性較低。 ②CYP2A6 的蛋白表達水平與CYP2A6 酶活具有一定的相關性，對目標活化體系進行CYP2A6 蛋白相對定量及代謝動力學研究可為煙氣體外毒理學評價中代謝活化體系的篩選提供依據。