ISTR標記在榧樹種質資源遺傳多樣性分析中的應用

俞飛飛 周軍永 陸麗娟

摘要：利用反向序列標簽重復技術（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）對43份安徽省榧樹種質資源及3份浙江省榧樹資源進行了遺傳多樣性分析。ISTR能很好地用于榧樹種質資源遺傳多樣性分析，多態性比例為87.09%，46份榧樹種質遺傳相似系數為0.548 4～1.000 0，表明安徽省榧樹種質資源遺傳多樣性較為豐富。采用UPGMA（非加權組平均算法）對46份種質的ISTR數據進行聚類分析，結果顯示可分為3個類群，來自同一地方的種質基本上都獨立聚成類群，表明種質間親緣關系與地理來源關系較為密切;相似的種質類型聚為一類，可能與實生繁殖方式有關。ISTR標記可在榧樹種質資源遺傳多樣性分析中被廣泛地應用。

關鍵詞：香榧;反向序列標簽重復技術;遺傳多樣性

中圖分類號： S791.530.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0038-03

榧樹（Torreya grandis）屬裸子植物紅豆杉科（Taxaceae）榧屬（Torreya）常綠喬木，為第3紀孑遺植物，是我國特有的珍稀樹種。安徽省榧樹種質資源豐富，多呈野生或半野生狀態，主要分布于黃山市的黟縣、休寧縣、歙縣、徽州區和黃山區，宣城市的寧國市、宣州區和績溪縣，池州市的石臺縣有少量分布，此外，大別山區的霍邱、舒城等地也有零星分布[1-6]。

反向序列標簽重復技術（inverse sequence-tagged repeat，ISTR）是逆轉座子的分子標記，較常規分子標記靈敏[7]，使用的是通用引物，免去了前期逆轉座子特異引物開發步驟，降低了試驗成本和提高了效率。目前已在椰子[8]、葡萄[9]、柑橘[10]和柿[11]等果樹樹種的指紋分析、遺傳連鎖圖譜構建、系統進化分析和種質鑒定等研究中得到應用。

隨著香榧經濟價值的不斷提高，榧樹的種質資源開發和利用受到重視，特別注重優良品質的榧樹資源利用，同時受到來自諸暨香榧等細榧品種的影響，安徽省很多野生和半野生的榧樹被改接，從而造成榧樹種質資源的流失，并且前人對安徽省榧樹資源遺傳多樣性的研究很少。本試驗擬探討ISTR標記在榧樹種質鑒定和親緣關系分析中應用的可行性，以期為今后開展遺傳多樣性評價、雌雄性別鑒定、種質鑒定和親緣關系分析等研究提供新的研究手段，對榧樹資源的保存利用具有重要的研究意義。

1 材料與方法

本研究中所采用的榧樹種質資源共46份（表1），于2017年6月采自安徽省榧樹主產區的寧國市、黟縣、宣城等地;其中諸暨香榧引自浙江省諸暨市。試驗于2017年8月在園藝作物種質創制及生理生態安徽省重點實驗室進行。

采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）提取榧樹葉片DNA，DNA終濃度稀釋至10 ng/μL備用。ISTR擴增及其產物檢測參考Rohde的方法并作優化[8]。引物序列參考Aga等的報道[12]（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系（20 μL）：模板DNA（2 μL），Buffer 1×（5 μL），Mg2+ 2.5×10-3 mol/L（5 μL），dNTP 2.5×10-3 mol/L（5 μL），Taq酶1 U（1 μL），引物1.0×10-6 mol/L（2 μL）。擴增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，循環35次;72 ℃延伸5 min。擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用SYNGENE凝膠成像系統觀察和記錄譜帶。

PCR擴增試驗重復2次，不能重復的條帶統計時忽略不計。強帶、弱帶均記為1，同一位置無帶記為0，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。用NTSYS-pc 2.10軟件進行相似系數計算和基于非加權組平均算法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的聚類分析，構建樹狀圖，分析榧樹種質資源親緣關系。

2 結果與分析

2.1 ISTR多態性分析

共篩選12對引物，其中4對引物的擴增譜帶清晰且重復性好。由表3可見，4對引物的擴增總帶數為31條，27條（占87.10%）具多態性;擴增片段長度為100～5 000 bp;單引物對多態位點比例為77.78%～100%;不同引物組合的種質鑒定能力差異較大，4對引物組合可以將46份種質資源按來源地區分，證明ISTR可用于榧樹種質資源遺傳多樣性研究。

2.2 品種及雌雄性鑒別

由4條引物擴增出的27個多態性位點，大多數譜帶在供試材料間不具有獨特性，來自寧國市方塘鄉的種質資源和諸暨香榧多態性豐富，能與其他種質資源明顯區分。圖1結果顯示， 17號樣本為雄性榧樹，在500 bp左右出現獨特性擴增位點，與雌性榧樹有明顯區分，作為雌雄性鑒定的依據有待于進一步研究。

2.3 基于ISTR的相似指數及親緣關系分析

46份榧樹種質遺傳相似系數為0.548 4～1.000 0，表明安徽榧樹種質資源遺傳多樣性較為豐富，其中來自黟縣的圓榧類種質的相似系數最大，為1.000 0，表明圓榧類的親緣關系最近。

采用UPGMA法，根據相似系數對46份榧樹種質進行聚類分析（圖2），在相似系數為0.82時，46份種質可分為3個類群。第1類群包含2份種質，來自寧國市方塘鄉。

第2類群包含7份種質，以相似系數0.87為界，可分為2個亞類，第1亞類包含4份種質，其中寧國市方塘鄉3份，寧國市青龍鄉1份;第2亞類含有3份種質，其中2份來自浙江?。ㄖT暨香榧），1份來自安徽省寧國市方塘鄉。

第3類群含有37份種質，以相似系數0.91為界，分為4個亞類。第1亞類包含30份種質，第2亞類僅含有1份種質（來自宣城市水東鎮），第3亞類包含5份種質，全部來自寧國市青龍鄉，第4亞類包含1份種質（來自寧國市青龍鄉）。在相似系數0.94處，第1亞類可分為5小類，第1小類包含8份種質，其中2份種質來自寧國市，1份種質來自宣城市，5份種質來自黟縣（5份種質聚為一類，且圓榧類種質親緣關系近，聚為一類）;第2小類包含4份種質，3份來自宣城市，1份來自寧國市;第3小類包含17份種質，8份來自宣城市，1份來自浙江?。ㄖT暨香榧），8份來自黟縣，其中來自黟縣的多為圓榧類種質，且聚為一類;第4小類僅包含1份種質（來自宣城市溪口鎮）。

3 討論

本研究中所使用的ISTR分子標記是基于椰子Ty1-copia逆轉座子序列開發而來的[8，12]，試驗的目的在于探討ISTR分子標記在榧樹種質資源中的適用性及其用于研究榧樹資源親緣關系的可行性。本試驗中ISTR多態性比例為8709%，多態性比例較高，且關于榧樹逆轉座子標記未見報道， 使用通用引物較以特異性引物開發為前提的逆轉座子標

記成本低，因此ISTR是較便捷的逆轉座子標記。

本試驗結果顯示，46份榧樹種質遺傳相似系數為 0.548 4～1.000 0，榧樹種質資源遺傳多樣性較為豐富。聚類分析結果顯示第1類群全部來自寧國市方塘鄉;第2類群包含7份種質，其中5份來自寧國市，2份來自浙江?。ㄖT暨香榧）;46份種質中的37份屬于第3類群，基本包含了所有的采樣地區，其中第1亞類包含30份種質，第2亞類僅含有1份種質（來自宣城市水東鎮），第3亞類包含5份種質，全部來自寧國市青龍鄉，第4亞類包含1份種質（來自寧國市青龍鄉）。第1亞類又分為5小類，第1小類包含8份種質，其中2份種質來自寧國市，1份種質來自宣城市，5份種質來自的黟縣;第2小類包含4份種質，3份來自宣城市，1份來自寧國市;第3小類包含17份種質，8份來自宣城市，1份來自浙江?。ㄖT暨香榧），8份來自黟縣，其中來自黟縣的多為圓榧類種質，且聚為一類;第4小類僅包含1份種質（來自宣城市溪口鎮）。由于安徽省榧樹資源分布呈現地域性，在相對獨立的環境中進化;同一地理來源的種質間基因交流頻繁，從而使親緣關系較近，遺傳變異系數相對較低;遺傳距離與地理距離具有一定的相關性，安徽省榧樹資源中來自同一區域的多聚為小類，但聚為一類的榧樹種質并非都來自同一地區，這可能與地區之間的引種有關，也可能與本試驗所選用的ISTR引物數量有限相關。此外，遺傳多樣性水平受繁育方式影響[13]，來自黟縣的種質資源多為圓榧類，親緣關系非常近，聚在一起，這可能與長期的實生播種繁殖方式有關。

本研究中所選的引物擴增出的多態性位點在供試材料間具有獨特性，來自寧國市方塘鄉的榧樹種質資源遺傳多樣性較為豐富。利用F8/B6引物組合進行擴增時，17號樣本（雄株）在500 bp左右出現獨特性擴增位點，與雌性榧樹有明顯區分，其特異性位點擴增作為雌雄性鑒定的依據有待于進一步研究。

本研究中ISTR產物使用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測手段獲得較好的結果，表明高濃度瓊脂糖凝膠電泳可用于檢測ISTR產物，提高了試驗效率[11]。試驗中發現用高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測部分引物擴增結果時，條帶有密集現象;目前報道多采用的聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測方式具有分辨率高等優點。因此，今后應依據試驗目的、遺傳背景等方面選擇ISTR產物檢測方式。

安徽省榧樹種質資源豐富，其中不乏新發現的優良株系[1]，但野生榧樹的低收益，使得農戶疏于管理或改接為諸暨香榧，從而造成榧樹種質資源的逐年減少，分析安徽省榧樹種質的遺傳多樣性有助于了解其親緣關系和從中篩選優良株系。本試驗探討ISTR標記在榧樹種質鑒定和親緣關系分析中應用的可行性，以期為今后開展遺傳多樣性評價、雌雄性別鑒定、種質鑒定和親緣關系分析等研究提供新的研究手段，對榧樹資源的保存利用具有重要的研究意義。

參考文獻：

[1]俞飛飛，郭新峰，陸麗娟，等. 寧國市榧樹種質資源調查及評價[C]//中國園藝學會2015年論文摘要集，2015：2620.

[2]梁淑云，丁之恩，胡文翠. 安徽香榧資源概況及栽培技術[J]. 經濟林研究，2006，24（2）：59-62.

[3]吳劍權. 黟縣香榧資源與栽培技術研究[J]. 安徽農學通報，2013，19（14）：71，85.

[4]俞飛飛，陸麗娟，周軍永，等. 安徽省榧樹種質資源調查及果實經濟性狀評價[C]//中國園藝學會2017年論文摘要集，2017：2500.

[5]呂玉蘭. 黃山區香榧產業現狀及發展對策[J]. 安徽農業科學，2014，42（20）：6898-6899.

[6]胡大榮. 徽州區香榧產業發展現狀及對策[J]. 安徽林業科技，2016，42（1/2）：49-51.

[7]Demey J R，Gamez E，Molina S，et al.Comparative study of the discrin inating capacity of AFLP and ISTR markers for genetic analysis of Agave fourcroydes[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2004，22：29-35.

[8]Rohde W.Inverse sequence-tagged repeat（ISTR） analysis，a novel and universal PCR-based technique for genome analysis in the plant and animal kingdom.[J]. Journal of Genetic and Breeding，1996，50：249-261.

[9]Sensi E，Vignani R，Rohde W，et al.Characterization of genetic biodiversity witnin Vitis vinifera L.Sangiovese and Colorino genetypes by AFLP and ISTR-DNA markers technology[J]. Vitis，1996，35：183-188.

[10]Tao N G，Wei J，Liu Y Z，et al.Copin-like retrotransposons in aprecocious mutant of trifoliate orange[Poncirus trifoliata （L.） Raf][J]. Journal of Horticultural Science and Biotechnology，2006，81（6）：5.

[11]杜曉云，張夢思，羅正榮，等. ISTR在部分柿屬植物種質鑒定和親緣關系分析中的應用[J]. 園藝學報，2009，36（4）：481-486.

[12]Aga E，Bryngelsson T.Inverse sequence-tagged repeat（ISTR） analysis of genetic variability in forest coffee（Coffea arabica L.） from Ethiopia[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53：721-728.

[13]Hamrick J L，Godt M J W. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological Sciences，1996，351：1291-1298.