1株苧麻生防內生細菌的分離鑒定及抑菌能力

孫向平 陳夢雅 張夢君

摘要：國內外關于苧麻的研究主要集中在作物栽培、高產育種、副產物多用途等，內生細菌的研究還比較少。利用表面消毒和組織分離法從苧麻的葉部篩選出1株生防內生細菌，通過平板對峙試驗測定它對苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌的抑制率。結果表明，該內生細菌對苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌具有很好的拮抗作用，抑制率分別達到53.6%、42.1%、34.8%。通過16S rDNA測序、Blast同源性比對發現，其與芽孢桿菌同源性最高。結合生理生化指標的測定結果，初步判定該菌株為蠟樣芽孢桿菌。試驗結果為對其生防機制的研究奠定了很好的基礎。

關鍵詞：苧麻;內生細菌;分離鑒定;生物防治;蠟樣芽孢桿菌

中圖分類號： S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0087-04

苧麻[Boehmeria nivea （L.） Gaud]為蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）多年生宿根性草本植物，別稱銀苧、苧根、山麻、天青地白草等，是一種重要的韌皮纖維作物，也是我國傳統的優勢特產，在國外被稱作“中國草”[1]。目前，國內外關于苧麻的研究主要集中在苧麻生理栽培、分子育種等方面，國內外關于苧麻內生菌的研究還比較少[2]。植物內生菌是指其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織器官內部或組織間隙中的微生物[3]，是目前已被廣泛研究的一種微生物資源[4]。

內生菌存在于植物的器官內，如植物的根、莖、葉、花、果實。每一種植物內存在的內生菌種類、數量與植物的種類、生存環境、生長階段、基因型以及營養的供給是否能滿足其生長有緊密的聯系[5]。而且相同的植物生長在不同的地區和不同的生活環境，其相同的組織中生長的內生菌種類和數量也有著明顯的差異，即便在同一地區，同一植物不同生長部位的植物內生菌的類群和數量也不一樣[6]。目前，已經報道的內生細菌大多數為固氮菌屬（Diazotrophicus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、 假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、泛菌屬（Pantoea）等[7]。

由于許多拮抗微生物同時具有對作物促生的作用，能兼治植物病害和環境污染等特點，引起越來越多的關注和重視[8]。因此，利用植物內生菌防治植物病原菌已經成為目前內生菌研究的熱點[5]。本研究從苧麻葉部分離出1株具有生防作用的內生細菌，利用常規理化性質及分子生物學手段對其進行菌株鑒定，并挖掘其生防潛力，以期豐富實驗室生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 內生細菌的分離和保存

2015年12月至2016年12月選取中國農業科學院麻類研究所培育的中苧1號苧麻新品種在湖南省益陽市沅江試驗基地進行栽培，2016年6月上旬取頭麻成熟期生長良好、無病害的健康植株樣品，放入樣品袋中帶回實驗室。將植物樣品清洗干凈放置于通風陰涼處，使其表面水分蒸發干燥，將苧麻進行根、莖、葉分離后立即進行內生菌的分離篩選。細菌培養采用營養瓊脂 （nutrient agar，簡稱NA） 培養基：牛肉膏 3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，pH值為7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌15 min。根、莖、葉內生細菌的合適消毒藥劑及消毒時間分別為2%次氯酸消毒2 min、0.1%硝酸消毒1 min、2%高錳酸消毒2 min。

在無菌操作下挑選出平板上形態、顏色、大小各異的菌落，單獨置于LB培養基上劃線培養，用封口膠帶包好置于 30 ℃ 恒溫培養箱中培養12～24 h，觀察細菌生長情況，若依然有不同形態菌落，繼續進行平板畫線培養直到分離出單一的菌落。

1.2 供試病原菌和培養基

試驗中供抗菌譜測定用植物病原菌包括苧麻白紋羽病病菌（Rosellinia necatrix）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum sp. cucumebrium Owen）、油茶炭疽病病菌（Colletotrichum camelliae Massee）。

真菌培養基采用馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖（或蔗糖）20 g，瓊脂15～20 g，pH值自然，121 ℃高壓滅菌15 min。將實驗室保存純化的多種病原菌的菌餅（0.8 mm）放于PDA培養基平板中央，對照設置為空白PDA培養基;將接種好的培養基放在25 ℃恒溫培養箱中，當病原菌菌絲長至1 cm左右，用滅菌的牙簽蘸取培養2 d的內生細菌單菌落，分別在距離病原菌 2.5 cm 處4點等距離對稱地點接，以只接種了植物病原菌的培養基為對照組，接完后用封口膠帶將培養基封好，放入 30 ℃ 恒溫培養箱中培養。

1.3 內生菌的拮抗作用鑒定

其中真菌性病原菌以PDA培養基進行對峙試驗，測定抑菌圈直徑。抑菌活性用抑菌圈直徑（mm）表示，抑菌圈直 徑= 透明圈直徑-孔徑（8 mm）。對照培養的病原菌的菌絲長滿平皿，觀察、拍照并統計有拮抗作用的平板，并測量抑菌圈的大小。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.4 內生菌的生理生化性狀測定

參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]以及《伯杰氏細菌鑒定手冊》[10]對苧麻葉內生菌Y9菌株的形態特征、生長曲線、生理生化指標進行鑒定。生長曲線測定以無菌的NA培養基為對照，于30 ℃、180 r/min振蕩培養，分別于0、6、12、18、24、30、36、48、60、72 h取樣，測量拮抗菌的D600 nm，繪制菌株生長曲線。

1.5 內生菌的16S rDNA基因序列測定及其分析

采用康為世紀細菌基因組提取試劑盒提取內生菌基因。PCR引物：25F（5′-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′），1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）;PCR反應體系：10.0 μL Mix，0.5 μL Taq酶，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.0 μL模板DNA，用ddH2O補足25.0 μL。Mix包括Buffer、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶。

PCR反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環;循環結束后 72 ℃ 延伸5 min，12 ℃保溫，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，最終測序結果在NCBI數據庫中進行Blast同源性比對。

2 結果與分析

2.1 抑菌廣譜性

由表1可知，苧麻內生細菌菌株Y9對苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌均有很好的抑制效果（圖1），其抑制率分別達到53.6%、42.1%、34.8%，其中對苧麻白紋羽病病菌的抑制效果最好。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 生長曲線鑒定與菌落形態特征 苧麻內生細菌Y9菌株的形態特征表征呈現圓形或不規則，表面有光澤，透明，沒有隆起，邊緣整齊，呈乳白色，沒有氣味，生長速度正常，具體見圖2。細菌生長曲線是指利用少量的單細胞微生物接種到三角瓶中進行培養，在不同的時間點測定其D600 nm來描述細菌的生長代謝周期。苧麻內生細菌Y9菌株的生長曲線見圖3，菌株Y9的生長周期為48 h，其中對數生長期在4～12 h之間。

2.2.2 生理生化特征測定結果 由表2可知，苧麻內生細菌Y9菌株的革蘭氏染色呈陽性。能利用葡萄糖，接觸酶、甲基紅、VP測定、硝酸鹽還原的測定結果均呈陽性，能產氨。吲哚乙酸、產硫化氫、檸檬酸利用、纖維素分解、解磷能力的測定結果均呈陰性。

2.2.4 進化樹分析結果 根據Blast同源性比對結果，對菌株Y9作進化樹分析。由圖4可知，菌株Y9為芽孢桿菌屬，結合其理化性質，參考《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步判定菌株Y9為蠟樣芽孢桿菌。

3 結論與討論

內生菌在不表現外在感染癥狀的健康植物組織內部生長，因此它的存在和作用一直以來容易被人們忽視。近年來研究表明，植物體內存在大量的對植物病原菌具有較好拮抗作用的內生菌。因此，從植物中分離內生菌和尋找具有良好生防效果的菌株備受關注[8]。內生菌是目前不可多得的天然微生物資源，它具有廣闊的研究和開發空間，可用于活性物質生產、經濟作物種植、環境保護、衛生保健等各個方面[5，11]。研究表明，植物內生菌能夠生活于植物體內的各個組織中，還可以在植物體內長期定殖并傳導，不容易受環境等各個方面的影響。內生細菌作為生防菌發揮作用時有許多制約因素，除內生細菌的生防機制和轉運外，植物的栽培條件、栽培措施，自然環境，微生態環境，細菌的形態穩定性等都影響內生細菌發揮作用[12-13]。

本研究經過嚴格的表面消毒程序，從健康的苧麻葉組織中分離得到1株對苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌有較強拮抗作用的內生細菌，通過對其形態學鑒定、生理生化特征測定，結合16S rDNA序列分析，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌，為進一步開展其生防機制的研究提供了基礎。目前主要應用的芽孢桿菌活菌制劑有蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等[14-15]。有研究表明，蠟樣芽孢桿菌可以降解血紅蛋白[16]，蠟樣芽孢桿菌BC98-Ⅰ發酵液與其抑菌粗提物對黃瓜枯萎病具有良好的抑制作用，使孢子萌發率降低、菌絲生長異常，且抑菌特性穩定，對外界環境有很強的耐受性和適用性[17]。芽孢桿菌作為土壤和植物微生態優勢種群之一，其抗逆性較強，同時能夠產生多種生物活性物質，目前已在農作物病蟲害生物防治中發揮了重要作用[18-20]。

本研究從苧麻上獲得了1株對苧麻白紋羽病病菌、油茶炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌具有良好拮抗效果的內生細菌，抑制率分別達到53.6%、42.1%、34.8%。根據其生理生化特征，參考《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》，結合16S rDNA測定結果，初步將該內生細菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌。該菌株具有一定的研發潛力，但其生物學特性、生防機制、發酵條件等還有待進一步研究。

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