基于表型性狀和CDDP分子標記延安萬花山牡丹遺傳多樣性分析

翟立娟 史倩倩 李想

摘要：利用28個表型性狀和CDDP分子標記對延安萬花山牡丹進行遺傳多樣性分析。結果表明，萬花山牡丹的表型性狀存在較大差異。質量性狀的香農多樣性指數變化范圍為0.28～1.21，其中花色、葉端形態(tài)、葉片顏色、花型等較高;9個數量性狀在樣本中差異極顯著，變異系數變化范圍為12.10%～69.23%，其中花瓣數、雄蕊數的變異系數較大。CDDP分子標記分析結果表明，萬花山牡丹有效等位基因數為1.599 4，Neis基因多樣性指數和香農多樣性指數分別為0.333 5和0.486 1，表明延安萬花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。2種分析方法結果具有一致性，均可將延安萬花山牡丹分為三大類，根據與紫斑牡丹和矮牡丹親緣關系可劃分為3個類型，即接近矮牡丹的類型、接近紫斑牡丹的類型和中間類型。

關鍵詞：牡丹;遺傳多樣性;表型性狀;CDDP分子標記

中圖分類號： S685.110.24 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0095-06

延安萬花山位于陜西省延安市城區(qū)西南方向，長期栽培多種牡丹品種，這些牡丹構成中原牡丹品種群延安牡丹亞群[1-2]。延安萬花山有延安牡丹（Paeonia yananensis）、矮牡丹（P. jishanensis）及紫斑牡丹（P. rockii）的野生居群[3-5]。關于延安萬花山牡丹類群的起源及物種地位有多種看法，鄭宏春等將萬花山上的牡丹劃分為4個變型，即白花矮牡丹、紫斑矮牡丹、紅花矮牡丹和紫斑紅花矮牡丹[6]。洪濤等將其中小葉數11枚、花粉色、花瓣有紫黑色瓣塊的牡丹提升到種的級別，即延安牡丹[3]。洪德元等認為，延安牡丹是矮牡丹和紫斑牡丹的雜交后代[7]，后人利用RAPD分子標記[8]、孢粉學[9]、形態(tài)學標記[4]、cpDNA序列和SSR分子標記[10]得到類似的結論。此地牡丹長期處于半野生半栽培狀態(tài)，在花型、花色等性狀方面存在較大變異[11]，是挖掘觀賞植物重要性狀的關鍵基因和牡丹新品種培育的良好試材[12]。李嘉玨的《中國牡丹》記載，該地至少有16個品種。然而，筆者調查發(fā)現該地牡丹品種數量正急劇減少，某些品種僅剩幾株，甚至不見蹤跡，如不采取保護措施，這將是牡丹育種栽培資源的一大損失，同時發(fā)現萬花山上保存著一些仍未命名或品種名遺失的牡丹樣本。目前缺乏關于延安萬花山牡丹品種及其遺傳多樣性的研究，這不利于該地牡丹資源的保存和合理開發(fā)利用。

表型多樣性是了解遺傳變異的重要線索[13]，具有操作簡單、直觀、便于觀察等優(yōu)點[14-15]。在牡丹野生種[16-17]和栽培品種[18]的遺傳多樣性研究中，得到了較可靠的結果。保守DNA序列多態(tài)性（conserved DNA-derived polymorphism，CDDP）分子標記是一種基于DNA保守序列的新型分子標記方法，具有穩(wěn)定性、重復性好的優(yōu)勢，能產生豐富的遺傳信息[19]，已在水稻[20]、菊花[21]、栽培牡丹[22]等植物遺傳多樣性研究中得到廣泛應用。因此，這2種方法的結合，可以從表型和基因型2個維度去準確、細致地了解其遺傳多樣性。

本試驗以分布于延安萬花山的24個牡丹樣本（包括10個形態(tài)能夠穩(wěn)定遺傳但尚未命名或品種名遺失的樣本、3個當地自然野生狀態(tài)下的牡丹樣本和11個已被記載的牡丹品種）為研究對象，以延安市富縣分布的紫斑牡丹和山西省稷山縣的矮牡丹為對照，采用28個表型性狀分析和CDDP分子標記技術相結合的方法研究延安萬花山牡丹的遺傳多樣性，以期為該地牡丹種質資源的保護和合理開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014—2016年連續(xù)3年于牡丹花期對延安萬花山牡丹進行資源調查，對性狀能夠穩(wěn)定遺傳且開花穩(wěn)定的24個類型進行表型性狀記錄，取每個類型的3～5個植株嫩葉用于DNA提取;同時以延安市富縣張家林場的紫斑牡丹（108.76° E、36.36° N，海拔1 461 m）和山西省稷山縣的矮牡丹（35.72° N、110.95° E）為對照進行試驗。試驗樣品的相關信息見表1和圖1，其中1～10號樣本尚未命名或品種名遺失，11～13號為萬花山當地自然野生狀態(tài)下的牡丹樣本，14～24號為已被記載的牡丹樣本[1，11]，25～26號為富縣紫斑牡丹，27號稷山縣的矮牡丹。

1.2 試驗方法

參照成仿云等的方法[2，15，18]選擇具有代表性、遺傳相對穩(wěn)定的28個表型性狀，其中19個質量性狀及賦值標準見表2，9個數量性狀見表3。利用改良的CTAB法[23]提取27份材料的DNA，然后參照李瑩瑩方法[19]利用14條CDDP引物進行PCR擴增，PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，凝膠成像系統觀察和保存電泳圖譜。

1.3 數據處理與統計分析

表型性狀數據統計中，利用SPSS 22.0軟件進行質量性狀的分布頻率分析、數量性狀單因素方差分析、采用Euclidean距離、Ward聚類方法進行Q型聚類[18]。各性狀的遺傳多樣性采用香農多樣性指數（H′）進行評價。對于CDDP帶型，首先按照電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無進行統計，形成0/1矩陣，然后應用POPGEN 32計算供試材料的有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、香農多樣性指數，最后運用NTSYS軟件進行UPGMA法構建聚類樹狀圖，其余計算由Excel 2007完成。

2 結果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

24個延安萬花山牡丹樣本質量性狀分布及多樣性情況見表2，香農多樣性指數（H′）的變化范圍為0.28～1.21，平均值為0.70。其中，多樣性指數最高的質量性狀是花色（1.21），主要以白色（25%）、粉色（37.5%）、紫紅色（33.33%）及復色（4.17%）為主;共有6個質量性狀的多樣性指數大于1， 包括葉端形態(tài)（1.08）、葉片顏色（1.01）、株型（1.03）、花型（1.07）及雄蕊瓣化情況（1.01）;葉面暈（0.29）、雌蕊瓣化（0.38）及房衣顏色（0.39）的香農多樣性指數（H′）相對較低;柱頭顏色的遺傳多樣性指數最低（0.28）。

F值說明了分析結果可靠程度和不同性狀在不同樣品間的差異程度。如表3所示，在群體水平上，延安萬花山牡丹的9個數量性狀的差異均達到極顯著水平（P<0.01），表明9個性狀在群體間層次上存在廣泛的變異。花瓣數在群體間F值最大（94.50）;雄蕊數和花徑的群體間F值較大，分別為81.90和45.98;外花瓣數的群體間F值最小（7.53）。多重比較結果（表3）顯示，盡管各數量性狀在居群間差異明顯，但是大多表現為連續(xù)變異。

數量性狀變異系數（CV）表示性狀的離散程度，反映表型的變異特征。延安萬花山牡丹種質資源的數量性狀（表3）變異系數變化范圍為12.10%～69.23%。其中花瓣數的變異系數最大，為69.23%，雄蕊數的變異系數較大，大于60%;小葉數量的變異系數（27.17%）、復葉長的變異系數（16.70%）、花徑的變異系數（13.31%）和著花量的變異系數（22.74%）均較小;葉柄長的變異系數最小，為12.10%。

根據28個表型性狀對所有材料進行Ward聚類分析，結果見圖2，在遺傳距離為15.5時，供試材料被分為3個大類，第Ⅰ大類包含2份紫斑牡丹，它們小葉數量在30枚以上，花絲為白色，心皮為黃白色;第Ⅱ大類包含22份樣本，包括了延安萬花山大部分牡丹樣本和矮牡丹，當地的矮牡丹（11、12號樣本）與稷山縣矮牡丹的親緣關系較近;第Ⅲ大類包含3份樣品，它們均為粉色，花型為皇冠型。在遺傳距離為9.5時，第Ⅱ大類的樣本又可以分為4類，第ⅰ類包含萬花山7號和萬花春（19號）2份樣本，它們的雄蕊均有少量瓣化;第ⅱ類包含6份萬花山牡丹樣本和1個矮牡丹，其均為單瓣型，花瓣基部沒有色斑;第ⅲ類包含7個樣本，其花瓣基部均有色斑，萬花山5號、瑞香紫（15號）、萬花山4號聚在一起，它們均為紫色花且花型為單瓣型;第ⅳ類包含6個樣本，除粉盤黃珠（18號）花型為單瓣型外，其余樣本花型為重瓣型。總體上講，大部分延安萬花山牡丹樣本在形態(tài)上更接近于矮牡丹。

2.2 CDDP的遺傳多樣性分析

利用14條CDDP引物對27份牡丹材料進行擴增，每條引物擴增出的條帶數、多態(tài)性條帶數和比例及其特異性條帶和比例均有較大的差異（表4），表明CDDP分子標記的多態(tài)性較高。利用POPGEN 32分析延安萬花山牡丹遺傳多樣性，得到有效等位基因數為1.599 4，Neis基因多樣性指數為 0.333 5，Shannon-Wiener信息指數為0.486 1，多態(tài)性位點數為109，多態(tài)性位點率為85.2%。結果表明延安萬花山的牡丹多態(tài)性較高。

根據Neis遺傳一致度，利用UPGMA法進行聚類分析（圖3）。在遺傳距離0.718處，可將樣本分為3個類群。其中，第Ⅰ類群包括14個萬花山牡丹和矮牡丹，其中的矮牡丹與萬花山11號的親緣關系最近。第Ⅱ類群包括9個樣本，2個野生紫斑牡丹屬于這一類群，此類群中樣本花瓣基多有色斑;第Ⅲ類群包括4個樣本，3號和10號親緣關系最近，之后與12號和5號樣本聚在一起。

2.3 表型性狀和CDDP分子標記的相關分析

在本研究中，2種方法的分析結果雖有差異，但也有一定的相關性。2種方法的香農多樣性指數（H′）分別為0.70和 0.486 1，說明延安萬花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。2種方法均可把27份樣本分為三大類，花瓣基部沒有色斑的多與矮牡丹聚在一起，花瓣基部有色斑的多于紫斑牡丹聚在一起;同一色系或相近花型的延安萬花山牡丹樣本遺傳距離較近。在2種方法的聚類樹狀圖中，萬花山9號和延州紅、獅子頭和延州粉均聚在一起，說明它們彼此之間親緣關系比較近。

3 討論與結論

研究牡丹遺傳多樣性的方法有形態(tài)學標記、細胞學標記、生理生化標記和分子標記[24]，其中形態(tài)學標記和分子標記使用最廣泛[25-27]。本研究中，延安萬花山牡丹種質資源的28個表型性狀存在明顯差異。CDDP分子標記獲得的Neis基因多樣性指數，香農多樣性指數多態(tài)性位點的比例均較高。2種方法均說明延安萬花山牡丹具有較高的遺傳多樣性。但2種方法的聚類結果也存在一定的差異，一方面是因為表型性狀是樣品的基因型值、環(huán)境效應、基因型與環(huán)境互作效應的綜合結果，而分子標記檢測的多態(tài)性只是DNA水平的變異;另一方面可能與其雜交起源遺傳背景有關。因此2種方法結合，才能更加準確地分析種群的遺傳變異狀況。

延安牡丹是臨近區(qū)域分布的紫斑牡丹和當地矮牡丹的雜交后代[10，12]。根據形態(tài)學分析，矮牡丹植株較矮，小葉多為9枚，近圓形或卵形，因頂生小葉分裂程度不同而表現9、11、15枚的變化;紫斑牡丹植株較高大，小葉數15枚及以上，多呈卵狀披針形，花色為白色、粉色和紫紅色[3-5];延安牡丹同時具有2個親本的性狀，小葉數11（13）枚，小型圓葉，花瓣基部具有紫黑色斑紋，主模式為瑞香紫中的1株[3，11]。本研究發(fā)現萬花山還存在許多類似于延安牡丹的半野生半栽培的牡丹樣本，小葉數15枚以上并呈卵狀（萬花山11號）、花瓣高度瓣化（萬花山3號）、花瓣基部有紅斑并且葉面有紅暈（萬花山7號）的類型或品種，明顯不同于矮牡丹和紫斑牡丹的性狀，說明延安萬花山牡丹存在豐富的變異，可以推斷為紫斑牡丹與矮牡丹的雜交后代只是在形態(tài)上出現了連續(xù)變異[28]。根據聚類結果，可以把萬花山的牡丹分為接近矮牡丹的類型，接近紫斑牡丹的類型及中間類型。接近矮牡丹的類型大致包括2、7、8、11、12、17、19、20號材料，它們多為單瓣型，花瓣基部沒有色斑;接近紫斑牡丹的類型包括4、13、14、15、18、21、22

號材料，它們花瓣基部多有色斑;中間類型包括1、3、5、6、9、10、16、23、24號材料，這些材料多為重瓣花型。對于延安萬花山牡丹的雜交機制還有待進一步研究。

本研究結果表明延安萬花山牡丹存在豐富的變異，具有較高的觀賞和科研價值。重瓣類型、具有色斑的類型、雄蕊少量瓣化的類型均可作為挖掘觀賞植物重要性狀的關鍵基因的重要種質資源。然而，目前延安萬花山牡丹種質資源流失嚴重，應該對萬花山地區(qū)的牡丹進行全面的資源清查和品種登記，加大科研力度，積極利用最新的育種和雜交技術，培育以延安萬花山地區(qū)的牡丹為基礎的新品種。

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