硬葉兜蘭菌根結構及菌根真菌空間分布特征

田凡 廖小鋒 顏鳳霞

摘要：為了解瀕危植物硬葉兜蘭菌根真菌在結構及分布方面的特征，采用切片法觀察其菌根結構，分離培養不同根齡菌根真菌、根不同部位的菌根真菌，并進行觀察、鑒定。結果表明，硬葉兜蘭菌絲團大多數分布于根部皮層細胞，菌絲團數量由外皮層向皮層細胞逐漸增加，皮層細胞向內皮層逐漸減少，內皮層和中柱細胞內沒有菌絲和菌絲團;皮層中間部位菌根真菌菌絲團數量最多，高于靠近表皮和靠近中柱部位的菌絲團數量;根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌，但根中部的菌根真菌數量最多;菌根真菌的種類和數量隨著根齡的變化而變化，隨著根齡的增加，菌根真菌種類和數量也相應地增加。

關鍵詞：硬葉兜蘭;菌根真菌;菌根結構;分布;特征

中圖分類號： Q934 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0105-04

蘭科（Orchidaceae Juss.）植物大多數依賴菌根真菌所提供的營養物質來促進種子萌發和幼苗生長[1]。部分具有綠色葉子和無葉綠素的蘭科植物，整個生長周期都須要與菌根真菌共生[2]。自20世紀初由Bernard和Burgeff揭示蘭科植物菌根之謎后，國內外相繼開展了大量的蘭科植物菌根真菌的研究。近年來也有一些學者對兜蘭屬（Paphiopedilum Pfitz.）植物菌根真菌進行了報道，李明等對杏黃兜蘭（Paphiopedilum armeniacum S. C. Chen & F. Y. Liu）菌根真菌進行了研究[3];Yuan等利用分子系統學方法，對比了野外與移栽到溫室2種不同生境的硬葉兜蘭（Paphiopedilum micranthum Tang & F. T. Wang）和杏黃兜蘭的菌根真菌多樣性[4];Nontachaiyapoom等收集了不同生境的兜蘭屬植物進行菌株分離，通過形態和分子鑒定出了Epulorhiza repens和Epulorhiza calendulina（均暫無中文名）類真菌[5]。

原產于我國兜蘭屬的硬葉兜蘭，花奇色美，具有非常高的觀賞價值[6]。由于采集過度、走私出境猖獗以及生境破壞等原因，近十幾年來野生硬葉兜蘭的數量急劇減少，分布區逐漸萎縮，已經到了滅絕的邊緣。硬葉兜蘭野生資源的保護和人工繁育問題亟待引起社會各界的重視。由于硬葉兜蘭的種子無胚乳，發芽率極低，雖然目前人工無菌播種已經獲得成功，但是出瓶率低、移栽難的問題還沒得到解決。將菌根真菌應用于種子萌發及幼苗的生長，可解決硬葉兜蘭人工有性繁殖難題。本研究對硬葉兜蘭菌根進行切片觀察并對其菌根真菌進行分離培養，分析硬葉兜蘭菌根結構及菌根真菌空間分布特點，以期為蘭科植物內生菌根真菌的特征增添素材，為硬葉兜蘭的人工繁殖及其保育工作提供理論基礎和實踐經驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為硬葉兜蘭成年植株根部，其植株采集于貴州省銅仁地區德江縣青龍鎮潮水河一帶。

1.2 試驗方法

1.2.1 徒手切片法 將硬葉兜蘭根在流水下沖洗干凈，選取具有菌絲團的根段，徒手切片，用乳酸石炭酸棉藍染色液染色，在OLYTMPUS DP70光學顯微鏡下觀察菌根結構特點并拍照。

1.2.2 菌株的分離培養 菌株分離培養參考Zhu等的單菌絲團分離法[7-8]，具體如下：

（1）根處理和含菌絲團根段的選擇。截取硬葉兜蘭新鮮根段分裝于盛有無菌水的培養皿中，無菌狀態下用解剖刀輕輕刮掉根被，顯微鏡檢，選出具有菌絲團的根段，用0.1%氯化汞溶液消毒2～3 min，無菌水沖洗 4～5次，然后用解剖針和鑷子刮菌絲團根段，使單菌絲團從皮層細胞中游離出來，24 ℃ 恒溫箱培養12 h后顯微鏡觀察。

（2）菌絲團的刮制方法。在顯微鏡下觀察，根據第1層（靠近表皮的2～3層細胞）、第2層（中間3～4層皮層細胞）和第3層（靠近中柱2～3層細胞）3個層次分別刮制于盛有無菌水的直徑為60 cm培養皿中。

（3）菌絲團的選擇及分離培養。在顯微鏡暗視野中找到生長出菌絲的菌絲團或菌絲結，利用1 000 μL的移液槍吸取菌絲團，轉接到1 cm2雙抗馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）培養基塊上，24 ℃恒溫箱培養。

（4）菌絲團的純化。顯微鏡下鏡檢小塊培養基，將開始生長的菌絲團從小塊培養基上切下，然后轉接至PDA培養基，24 ℃恒溫培養。

1.2.3 菌株鑒定 菌種鑒定依據菌株菌落的培養特征及菌株顯微形態觀察的結果，結合文獻資料，綜合分析對比相關特征的異同，最后確定鑒定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 硬葉兜蘭菌根結構

顯微鏡下觀察硬葉兜蘭根的縱切面和橫切面，從外至內依次為根毛（RH）、根被（velamen）、外皮層（exodermis）、皮層（cortex）、內皮層（endodermin）和維管柱（vascular cyhinder）。根被組織由4～5層厚壁、多角死細胞組成，細胞扁長，排列較松散。外皮層緊貼根被內側，由1層細胞組成，細胞體積較大，排列也較規則，其中大部分細胞為胞壁增厚的死細胞。皮層由15～17層薄壁細胞組成，其中靠近外皮層與內皮層的 1～2層細胞體積相對較小，中部的皮層細胞體積較大，皮層細胞中含有針狀結晶和菌根真菌形成的菌絲團。Rasmussen用苯胺藍對蘭科植物原球莖中的針狀結晶研究表明，針狀結晶是植物酸鈣，硬葉兜蘭菌根中的針狀結晶可能也是這類物質[9]。內側靠中柱（VB）的一層是內皮層，具有明顯的凱氏帶（casparian strip）。內層是維管柱，中柱鞘（pericycle）由1層細胞構成，木質部（xylem）與韌皮部（phloem）交替分布（圖1-a至圖1-f）。

在皮層薄壁組織中清晰地觀察到大量的菌絲團（pelotons）和少量松散的菌絲，菌絲團近橢圓形，皮層細胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細胞壁（CW）形成菌絲連接（PC）而侵染另一細胞（圖1-a）;菌絲團中或附近也觀察到了念珠狀細胞（B）（圖1-b）;在圖1-c中可以看出菌絲順著根毛進入根被。菌絲團中或附近也觀察到了大量的念珠狀細胞，在皮層細胞中，菌絲團常常分布在靠近細胞核（N）的部位，這與范黎等在其他蘭科植物中觀察到的現象[10-11]類似。菌根真菌在皮層細胞內形成菌絲結，可看到皮層細胞內分布著著色棕色或深棕色形態形狀不規則的菌絲結等結構，這與丁暉等對蘭花菌根結構研究的結果[12-13]類似。菌絲團主要分布于皮層細胞的3～5層中，且非均勻分布于整個橫截面（圖1-e）。皮層細胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細胞壁而侵染另一細胞，并再次形成菌絲結（圖1-a）。而在中柱（微管柱）中既沒有菌絲團，也沒有菌絲。蘭科植物在真菌感染后形成菌絲團等結構是形成共生關系最直觀、最可靠的證據。在硬葉兜蘭根的皮層細胞中明顯觀察到菌絲團、菌絲團之間的菌絲連接、松散的菌絲團以及消解中的菌絲團（DP）（圖1-e），強有力地證明了在自然界硬葉兜蘭與真菌形成典型菌根結構，二者為共生關系。

2.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布特征

由表1可知，由根尖向根基部，菌根真菌分離的數量和種類都有一定的變化特點。首先，從分離數量的變化上看，由根尖至根基逐漸減少;其次，菌絲團的萌發活力則是由根尖中菌絲團的分離率13.5%逐漸降至向根基部中菌絲團分離率的8.3%;最后，從分離種類的變化上看，根尖和根中部的種類最多，都為3種，根基部只分布1種菌根真菌。硬葉兜蘭的根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌，但其分布由根尖向根基部逐漸減少。

2.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布特征

由表2可知，從菌絲團分布上來看，菌絲團大多數分布于皮層細胞（皮層中間3～4層細胞）;菌絲團活力上來看，由外皮層向內皮層，菌絲團活力逐漸降低，分離率由外皮層及其臨近的1～2層皮層細胞中菌絲團的分離率20.5%降至內皮層及其臨近的1～2層皮層細胞中菌絲團的分離率0;從種類分布上來看，硬葉兜蘭3年生根皮層中間3～4層細胞中菌根真菌的種類最多，而第3層（靠近中柱2～3層細胞）沒有分離到菌根真菌。

2.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌種類及數量

由表3可知，從菌絲團數量上來看，2年生根菌絲團數量最多，其次是3年生根，1年生根菌絲團的數量明顯最少;萌發生長率與菌絲團的數量關系不大，1年生根菌絲團的萌發率略大于2年生根，3年生其次，但表3的比率差值不大。從菌根真菌種類上來看，2年生根分離的種類最多，1年生根中的菌根真菌種類最少。硬葉兜蘭菌根真菌的種類和數量隨著根齡的變化而變化，隨著根齡的增加，菌根真菌種類和數量也相應地增加，反之，菌絲團的活力則減少。

3 討論

3.1 硬葉兜蘭菌根真菌入侵方式

顯微結構觀察表明，硬葉兜蘭具有典型的蘭科菌根結構。在皮層細胞內形成菌絲結，菌絲通過穿透細胞壁侵染鄰近細胞，并再次形成菌絲結，皮層細胞中分布著大量的菌絲和菌絲團狀，前者逐漸被植物的根細胞消解、吸收，而后者會在前者消解之后形成新的菌絲團。這種菌絲被消化又重新定殖的現象在整個植株發育過程中不斷重復，再次驗證了菌絲團和蘭科植物之間的相互作用，進一步肯定了蘭科植物與菌根真菌生長主要營養方式的理論。

丁暉等曾觀察到，在具有通道細胞的蘭科植物中，菌絲侵入時常不破壞根被，通過根毛或表皮細胞及外皮層薄壁通道細胞直徑侵入[12，14]。在對硬葉兜蘭菌根的觀察中目前只在根毛或表皮細胞中觀察到菌絲，由此可以認為真菌是通過根毛進入根被細胞，進一步向通道細胞和皮層細胞入侵，但其侵入機制還須要進一步深入研究。

3.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布變化特征

據文獻記載，蘭科植物根尖的分生組織有蘭酚類物質抵制真菌的侵入[15]。硬葉兜蘭菌根中部的菌根真菌數量最多，這與春蘭菌根的定植特點相同[16]，由此可以看出土壤微生物是先從根中部入侵，隨后向其兩端逐漸蔓延。硬葉兜蘭菌根中部分離到氣生菌絲發達的mycorrhizal basidiomycete菌根真菌和氣生菌絲不發達的Epulorhiza sp.、Psathyrella candolleana真菌。說明氣生菌絲發達和氣生菌絲不發達的菌株種類間不具有競爭性，是相互協同的共生作用。然而，是氣生發達菌絲先定殖根皮層細胞，還是氣生不發達菌絲先定殖根皮層細胞能更好地促進蘭科植物的生長，維持長效的共生關系，這有待下一步的研究。

3.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布變化特征

由硬葉兜蘭3年生根菌根真菌的橫向分布的種類和數量可知，菌根真菌的分離率由外皮層向皮層細胞逐漸增加，由皮層細胞向內皮層逐漸減少，內皮層和中柱細胞內沒有菌絲和菌絲團。經過分離培養得出，3個層次的皮層細胞都以氣生菌絲不發達的菌株種類為主，這有助于維持菌根共生關系，不會因內生菌生長過快而導致蘭科植物枯萎。

3.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌動態變化特征

1年生和2年生分離到的5種菌株的氣生菌絲都不明顯，生長較慢，其中Psathyrella candolleana菌株為優勢菌，此菌株在雙抗PDA培養基上不形成氣生菌絲且生長較慢，而3年生根分離到的Psathyrella sp.菌株在雙抗PDA培養基上，氣生菌絲發達，生長速度較快。硬葉兜蘭早期以生長較慢的菌根真菌為主，后期以生長較快的菌根真菌為主;早期以產生少量氣生菌絲為主，后期以產生大量氣生菌絲或氣生菌絲不明顯為主。生長慢的內生菌侵入為生長快的內生菌創造了較為適宜的生長條件，促進生長快的內生菌定殖。這樣的定殖方式有助于菌根真菌的協同作用，促進和維持菌根的共生關系。

參考文獻：

[1]Zelmer C D，Currah R S. Ceratorhiza pernacatena and Epulorhiza calendulina spp. nov.：mycorrhizal fungi of terrestrial orchids[J]. Canadian Journal of Botany，1995，73（12）：1981-1985.

[2]Rasmussen H N，Rasmussen F N. Trophic relationships in orchid mycorrhiza-diversity and implications for conservation[J]. International Journal on Orchidology，2007，7（1/2）：334-341.

[3]李 明，張 灼. 杏黃兜蘭菌根研究與應用[J]. 生物學雜志，2001，18（6）：17-18.

[4]Yuan L，Yang Z L，Li S Y，et al. Mycorrhizal specificity，preference，and plasticity of six slipper orchids from south western China[J]. Mycorrhiza，2010，20（8）：559-568.

[5]Nontachaiyapoom S，Sasirat S，Manoch L . Isolation and identification of Rhizoctonia-like fungi from roots of three orchid genera，Paphiopedilum，Dendrobium，and Cymbidium，collected in Chiang Rai and Chiang Mai provinces of Thailand[J]. Mycorrhiza，2010，20（7）：459-471.

[6]陳心啟，劉芳媛. 云南幾種兜蘭屬植物[J]. 植物分類與資源學報，1982，4（2）：163-167.

[7]Zhu G S，Yu Z N，Gui Y，et al. A novel technique for isolating orchid mycorrhizal fungi[J]. Fungal Divers，2008，33（12）：123-137.

[8]朱國勝. 貴州特色藥用蘭科植物杜鵑蘭和獨蒜蘭共生真菌研究與應用[D]. 武漢：華中農業大學，2009.

[9]Rasmussen H N. Cell differentiation and mycorrhizal infection in Dactylorhiza majalis （Rchb. f.） Hunt & Summerh （Orchidaceae） during germination in vitro[J]. New Phytologist，1990，116（1）：137-147.

[10]范 黎，郭順星，肖培根. 密花石斛等6種蘭科植物菌根的顯微結構研究[J]. 植物學通報，2000，17（1）：73-79.

[11]Hadley G，Williamson B. Features of mycorrhizal infection in some malayan orchids[J]. New Phytologist，1972，71（6）：1111-1118.

[12]丁 暉，韓素芬，王光萍，等. 卡特蘭與絲核菌共培養體系的建立及卡特蘭菌根顯微結構的研究[J]. 菌物學報，2002，21（3）：425-429.

[13]陳連慶，裴致達，韓寧林，等. 3種石斛菌根形態結構及元素構成的研究[J]. 林業科學研究，2002，15（1）：96-100.

[14]Esnault A L，Masuhara G，Mcgee P A . Involvement of exodermal passage cells in mycorrhizal infection of some orchids[J]. Mycological Research，1994，98（6）：672-676.

[15]潘超美，陳汝民，葉慶生. 野生建蘭菌根的顯微結構特征[J]. 廣西中醫藥大學學報，2002，19（1）：60-62.

[16]桂 陽，劉作易. 春蘭菌根結構的研究[J]. 貴州農業科學，2006，34（2）：18-19.