不同氮磷比對小球藻葉綠素熒光參數(shù)及生長的影響

薄香蘭 劉興 竇勇

摘要：以小球藻（Chlorella vulagris）為研究對象，研究不同氮磷比對其葉綠素熒光、葉綠素含量和細胞密度的影響，以期找到小球藻生長最適的氮磷比，為小球藻的規(guī)模化培養(yǎng)提供基礎資料。結果表明：不同濃度的氮磷比對小球藻的葉綠素熒光、葉綠素含量和細胞密度有顯著影響，各處理組均呈上升趨勢，其中17.30 ∶ 1處理組的最大光能轉化速率Fv/Fm、潛在活力Fv/Fo、實際光能轉化效率ΦPS Ⅱ和量子效率Yield、相對電子轉化速率ETR均高于其他處理組，34.60 ∶ 1 處理組葉綠素含量和細胞密度最高，其值分別為3 231.81 μg/L和1.07×107個/mL。138.40 ∶ 1處理組上升趨勢最小，且各處理組的熒光參數(shù)指標在試驗后8 d開始呈下降趨勢。小球藻在氮磷比為17.30 ∶ 1生長最好。

關鍵詞：小球藻;葉綠素熒光參數(shù);葉綠素含量;細胞密度;氮磷比

中圖分類號： S184 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0169-04

氮和磷是藻類生長中最常見的限制因子[1]，氮是蛋白質和葉綠素等物質的組成成分，限氮會影響植物葉綠素的合成，進而影響到其光合作用[2]。磷作為藻類生長發(fā)育的必需元素直接參與光合作用的各個過程，限磷會影響光合磷酸化水平，使代謝合成受阻，光合速率下降[3]。因此，水體中的氮磷比（N/P）直接影響藻類細胞的生長及物質的積累[4]。目前關于氮磷比對藻類的研究大都集中在對藻類生物量和群落結構變化的影響上[5-6]，對葉綠素熒光動力學參數(shù)和葉綠素含量的研究比較少。

葉綠素熒光現(xiàn)象是在1834年由傳教士Brewster最先發(fā)現(xiàn)的[7]，1932年由Kautsky和Hirsch發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象和光合特性之間的關系[8]，1986年Schreiber發(fā)明了可以檢測熒光誘導動力學的PAM儀器（pulse-amplitude-modulation）[9]。作為光合作用的良好探針，葉綠素熒光參數(shù)是鑒定藻類耐逆境能力的良好指標之一，具有快速、準確、簡單的特點[10-11]。小球藻在分類上屬于綠藻門，個體微小，營養(yǎng)豐富，易于繁殖，在動物飼料、食品添加劑、美容產(chǎn)品、食品開發(fā)、醫(yī)藥保健等領域都有巨大的應用潛力。本試驗利用葉綠素熒光儀（PHYTO-PAM WALZ），在保持磷不變的基礎上，設置5個氮磷比梯度，通過檢測葉綠素熒光參數(shù)和藻密度，以期找到適合小球藻生長的氮磷比，為小球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供參考依據(jù)，同時，為葉綠素熒光現(xiàn)象在確定藻類適宜氮磷比值上的可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與時間地點

試驗用小球藻（Chlorela vulagris）來源于天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室。

試驗時間為2017年5月10—20日。試驗地點為天津農學院水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)條件

將初始密度為1×106個/mL的小球藻藻液以1 ∶ 1的比例接種于藍綠培養(yǎng)基（BG-11 medium for blue green algae，BG-11培養(yǎng)基）中，以硝酸鈉（NaNO3）為氮源，設置5個氮磷比梯度，分別為8.65 ∶ 1（NaNO3濃度為2.5 mol/L）、17.30 ∶ 1（NaNO3濃度為5 mol/L）、34.60 ∶ 1（NaNO3濃度為10 ml/L）、69.20 ∶ 1（NaNO3濃度為20 mol/L）、138.40 ∶ 1（NaNO3濃度為40 mol/L），光照條件為60 μmol/（m2·s），溫度為25 ℃，光—暗比為12 h—12 h，每組設定3個平行，于恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天定時搖動4次，以防小球藻細胞附壁及下沉。

1.3 試驗儀器

葉綠素熒光儀（PHYTO-PAM WALZ）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備工廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（HVE-50 HIRAYMA儀器制造公司）、生物顯微鏡（E200日本Nikon）、藻類培養(yǎng)箱（AL-36美國珀爾瓦西）、電子天平（AS2202X2 RADWAG）。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 微量元素溶液（A5） 將2.86 g的硼酸（H3BO3）、1.86 g 的四水氯化錳（MnCl2·4H2O）、0.22 g的七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、0.39 g的鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、0.08 g的五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0.05 g的六水硝酸鈷 [CO（NO3）2·6H2O]依次溶于1 L的蒸餾水中。

1.4.2 BG-11培養(yǎng)基 將1.5 g的硝酸鈉（NaNO3）、0.052 g 的磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、0.075 g的硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0.036 g的氯化鈣（CaCl2·2H2O）、0.006 g的檸檬酸、0.006 g的檸檬酸鐵胺、0.001 g的EDTA（Na2）、0.2 g 的碳酸鈉（Na2CO3）、1 mL的A5溶液依次溶于1 L的蒸餾水中。

1.5 測定方法

將處于對數(shù)期的小球藻接種到配好的培養(yǎng)基中，并記錄為試驗的0 d，在試驗后0、2、4、6、8、10 d定時取樣，測定葉綠素熒光參數(shù)、葉綠素含量和藻密度。

1.5.1 葉綠素熒光參數(shù)的測定 利用浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAM WALZ）對葉綠素熒光各個參數(shù)進行測定，打開Phyto Win軟件，先放置1 cm樣品（每次體積應統(tǒng)一）在比色皿中暗適應15 min，啟動儀器測定初始熒光產(chǎn)量（Fo），飽和脈沖后測定最大熒光產(chǎn)量（Fm），以此計算出最大光能轉化效率（Fv/Fm），打開預先設定好的光化學強度，進行1 min的照射（儀器指示燈變綠為光化學結束），待熒光值穩(wěn)定后，測定出光化學后初始熒光（Fs）和最大熒光（Fm′）。Settings窗口中將Meas. Freq.設置為32，切換到Channeles窗口，點擊CHL，測出葉綠素的含量。測定的葉綠素熒光參數(shù)有Fo、Fm、Fo′、Fm′、Fs，并根據(jù)熒光儀提供的公式計算出Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、ETR、ΦPSⅡ等熒光參數(shù)。

1.5.2 藻密度測定 小球藻密度測定通過血球計數(shù)板計數(shù)獲得。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和多重比較，利用Excel 2007進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同氮磷比對小球藻葉綠素熒光活性的影響

2.1.1 不同氮磷比對小球藻Fv/Fm的影響 Fv/Fm反映了光反應中心PS Ⅱ的最大量子產(chǎn)量，即最大光能轉化效率，在受到環(huán)境條件脅迫時，其值會降低，此指標常用來判斷植物是否受到條件抑制[12]。由圖1可知，在整個培養(yǎng)期間，各處理組的Fv/Fm均呈上升趨勢，以17.30 ∶ 1處理組最高，34.60 ∶ 1 次之，138.42 ∶ 1最低，至培養(yǎng)結束時，34.60 ∶ 1、8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1、138.40 ∶ 1處理組的最高值各維持在17.30 ∶ 1處理組最高值的97.73%、91.84%、86.81%、80.58%，說明本試驗設置的5組氮磷比對小球藻Fv/Fm值沒有抑制作用，同時，各組的Fv/Fm均在8 d后呈下降趨勢，說明此時各組的氮磷比都不能滿足藻類的生長需求，推測原因是營養(yǎng)鹽消耗殆盡的結果。17.30 ∶ 1處理組的Fv/Fm從試驗后 2 d 開始就高于其他各組，說明小球藻對該濃度的氮磷比適應良好。

2.1.2 不同氮磷比對小球藻Fv/Fo的影響 Fv/Fo反映了光反應中心PS Ⅱ的潛在活性，其值受到脅迫時下降，是用來判斷光合作用是否受到抑制的指標之一[13]。由圖2可知，各處理組的Fv/Fo在試驗后0～8 d呈上升趨勢，在試驗后8 d后開始下降，培養(yǎng)結束時，以17.30 ∶ 1處理組最高，34.60 ∶ 1次之，138.40 ∶ 1最低。各組Fv/Fo值在試驗后2 d開始上升，說明此時的氮磷比都能滿足光反應中心PS Ⅱ吸收量子的能力，在試驗后 8 d 各組都呈下降趨勢，表明此時小球藻的光合作用開始受到抑制。

2.1.3 不同氮磷比對小球藻ΦPS Ⅱ的影響 ΦPS Ⅱ是指光反應中心PS Ⅱ的實際光能轉化效率[14]。由圖3可知，所有處理組的ΦPS Ⅱ的在試驗后0 d均維持在0.28±0.01，且隨著時間增加呈上升趨勢，以17.30 ∶ 1組的ΦPS Ⅱ值最高，之后依次為 34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。到試驗后 10 d，138.40 ∶ 1處理組的ΦPS Ⅱ維持在17.30 ∶ 1處理組的75.11%。

2.1.4 不同氮磷比對小球藻Yield的影響 Yield指在光合作用中每吸收一個光量子，所固定CO2分子數(shù)或者釋放O2的分子數(shù)[15]。由圖5可知，各處理組的Yield均在第8 d時達到峰值，至培養(yǎng)結束時，17.30 ∶ 1處理組較峰值下降93.30%，34.60 ∶ 1 處理組較峰值下降92.42%，8.65 ∶ 1、69.20 ∶ 1 和138.40 ∶ 1處理組較峰值下降差別不大，分別為88.46%、88.51%、88.56%。PSⅡ量子下降的速率，說明光反應中心受抑制的程度越嚴重，代謝合成受到阻礙程度越高。

2.1.5 不同氮磷比對小球藻ETR的影響 ETR表示光反應中心PS Ⅱ光合電子的傳遞速率，圖5顯示， 在小球藻的一次性培養(yǎng)過程中，各處理組的ETR值呈上升趨勢，依次為 17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在試驗后8 d出現(xiàn)下降趨勢。

2.2 不同氮磷比對小球藻葉綠素含量的影響

藻體內的葉綠素含量與其光合作用、生長密切相關。圖6表明，隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理組葉綠素含量不斷增加，培養(yǎng)結束時，以34.60 ∶ 1處理組葉綠素含量最高，其值為3 231.81 μg/L，17.30 ∶ 1處理組次之，其值為 2 964.44 μg/L，接下來依次為69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1>8.65 ∶ 1。

2.3 不同氮磷比小球藻細胞密度影響

不同氮磷比對小球藻細胞密度影響見圖7，隨著培養(yǎng)時間的增加，各處理組的細胞密度均呈上升趨勢，其中以 17.30 ∶ 1 μmol/L 處理組細胞密度增加最快，在試驗后10 d，細胞密度達到1.07×107個/mL，為接種時的2.50倍。34.60 ∶ 1 處理組次之，培養(yǎng)結束時細胞密度為接種時的2.31倍。138.40 ∶ 1處理組增長最慢，培養(yǎng)結束時細胞密度為初始接種量的2.01倍。至培養(yǎng)結束時，各組細胞密度依次表現(xiàn)為34.60 ∶ 1>17.30 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1。

3 討論與結論

葉綠素熒光技術以藻類葉綠體的細胞器官為材料，反映光合作用過程中的光能吸收、激發(fā)能傳遞、光化學反應、電子傳遞、質子梯度的建立、ATP合成和CO2固定等光合作用的動態(tài)變化及各種外界因素對藻類的微妙影響[16-17]，其原理是藻類細胞內的葉綠素分子通過直接或間接吸收光量子獲得能量后，從基態(tài)（低態(tài)能）飛躍到激發(fā)態(tài)（高態(tài)能）[18]，熒光是在電子從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)的過程中產(chǎn)生的[19]。熒光各參數(shù)指標與逆境受脅迫程度存在密切的相關性，當藻類在逆境條件發(fā)生光抑制時，葉綠素各熒光參數(shù)均呈下降趨勢[20]。本試驗結果表明，小球藻氮磷比為17.30 ∶ 1時各熒光參數(shù)指標值最高，在氮磷比為34.60 ∶ 1時葉綠素含量和細胞密度最高。從試驗后0～8 d各組葉綠素熒光參數(shù)指標均呈上升趨勢，說明本試驗設置的5組氮磷比梯度并未對小球藻的光合系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，光能轉化效率始終保持在較活躍的狀態(tài)。從試驗后8 d Fv/Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、Yield開始出現(xiàn)下降趨勢，說明光反應中心PSⅡ受到損害，電子傳遞速率下降，導致光合作用各反應過程受到抑制，其主要是由于隨著培養(yǎng)時間的增加，氮磷等營養(yǎng)鹽消耗殆盡，不能滿足藻類光合作用中吸收量子所需要的能量消耗[21]，進而表明本試驗的小球藻生長周期為8 d。雷玉新等研究了不同氮磷質量濃度比的培養(yǎng)液對藍藻生長和葉綠素的影響，發(fā)現(xiàn)水體中氮磷比為40 ∶ 1時，藍藻的生長速率和葉綠素含量達到最大值[22]。李慧等研究發(fā)現(xiàn)，當?shù)妆葹?0 ∶ 1時，銅藻幼苗的特定生長率最大[23]。陳慶榮等研究發(fā)現(xiàn)，在氮磷源充足的情況下，青島大扁藻生長最佳的氮磷比是7.17 ∶ 1;當?shù)谞I養(yǎng)鹽受到限制的情況下，青島大扁藻生長最佳的氮磷比例是13.71 ∶ 1[24]。劉東艷等研究表明，氮磷比在16 ∶ 1的條件下，球等鞭金藻的生長速度最快，單位水體內的細胞數(shù)量最多，細胞內碳水化合物和蛋白質的含量也最高[25]。李冰研究發(fā)現(xiàn)，小球藻最適應的氮磷濃度比為16 ∶ 1[26]，與本試驗研究結果相近。由于不同藻類對氮磷吸收利用率的差異，氮磷比對藻類生長的影響并不表現(xiàn)在一個固定數(shù)值上。

傳統(tǒng)測定藻類最適氮磷比的方法就是在不同氮磷比的培養(yǎng)條件下測定藻類的細胞密度，這種方法比較耗時，而且準確度低。本試驗通過測定葉綠素各熒光參數(shù)和葉綠素含量并結合細胞密度發(fā)現(xiàn)，各熒光指標、葉綠素含量與細胞密度有密切的相關性。按增長的速率來看，各組數(shù)值依次為17.30 ∶ 1>34.60 ∶ 1>8.65 ∶ 1>69.20 ∶ 1>138.40 ∶ 1，在整個培養(yǎng)周期，各熒光指標和細胞密度有著顯著的正相關關系。因此，利用葉綠素熒光各項參數(shù)的變化可以反映小球藻在不同培養(yǎng)條件下的生長情況。陳書秀等研究表明，雨生紅球藻進行光合作用和生長最適氮濃度為1 760 μmol/L;最適磷濃度為 18.16 μmol/L，葉綠素相對含量均與細胞密度呈顯著的正相關關系[27]，與本試驗結果一致。目前，有許多學者利用葉綠素熒光技術來對藻類進行抗逆性研究，如王昭玉利用葉綠素熒光技術對氮、磷限制的響應，來判斷山東青島近海的氮、磷限制情況[28]。孫開明采用葉綠素熒光技術測定不同營養(yǎng)鹽條件下的東海原甲藻的葉綠素參數(shù)與生長參數(shù)，研究外部營養(yǎng)鹽濃度及吸收速率的關系[29]。許珍等利用此技術研究溫度、光照度對漢斯冠盤藻、小環(huán)藻、斜生柵藻和銅綠微囊藻生長的影響[30]。隨著葉綠素熒光技術的進一步完善和機理的明確，此技術在藻類的其他方面也會發(fā)揮重要的作用。

參考文獻：

[1]孫凱峰，肖愛風，劉偉杰，等. 氮磷濃度對惠氏微囊藻和斜生柵藻生長的影響[J]. 南方水產(chǎn)科學，2017，13（2）：69-76.

[2]Pancha I，Chokshi K，George B，et al. Nitrogen stress triggered biochemical and morphological changes in the microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077[J]. Bioresource Technology，2014，156（2）：146-154.

[3]He G，Zhang J，Hu X，et al. Effect of aluminum toxicity and phosphorus deficiency on the growth and photosynthesis of oil tea （Camellia oleifera Abel.） seedlings in acidic red soils[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2010，33（4）：1285-1292.

[4]王英英. 不同氮磷質量濃度對太浦河四種優(yōu)勢藻類生長影響的研究[D]. 上海：上海師范大學，2016.

[5]鄭 杰，黃顯懷，尚 巍，等. 不同氮磷比對藻類生長及水環(huán)境因子的影響[J]. 工業(yè)用水與廢水，2011，42（1）：12-16.

[6]Xin L，Hu H Y，Ke G，et al. Effects of different nitrogen and phosphorus concentrations on the growth，nutrient uptake，and lipid accumulation of a freshwater microalga Scenedesmus sp.[J]. Bioresource Technology，2010，101（14）：5494-5500.

[7]韓博平. 藻類光合作用機理與模型[M]. 北京：科學出版社，2003.

[8]宋麗娜，鄭曉宇，顧詠潔，等. 磷濃度對海洋小球藻葉綠素熒光及生長的影響[J]. 環(huán)境污染與防治，2010，32（8）：20-24.

[9]Schreiber U. Detection of rapid induction kinetics with a new type of high frequency modulated chlorophyll fluorometer[J]. Photosynthesis Research，1986，9（1/2）：261-272.

[10]胡豐姣，黃鑫浩，朱 凡，等. 葉綠素熒光動力學技術在脅迫環(huán)境下的研究進展[J]. 廣西林業(yè)科學，2017，46（1）：102-106.

[11]Lechaudel M，Urban L，Joas J. Chlorophyll fluorescence，a nondestructive method to assess maturity of mango fruits （cv. ‘Cogshall） without growth conditions bias[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2010，58（13）：7532-7538.

[12]Guo H，Yao J，Sun Z，et al. Effect of temperature，irradiance on the growth of the green alga Caulerpa lentillifera（Bryopsidophyceae，Chlorophyta）[J]. Journal of Applied Phycology，2015，27（2）：879-885.

[13]呂士如. 基于藻類葉綠素熒光動力學曲線的水質監(jiān)測系統(tǒng)的設計[D]. 重慶：重慶大學，2014.

[14]Miyake C，Amako K，Shiraishi N，et al. Acclimation of tobacco leaves to high light intensity drives the plastoquinone oxidation system-relationship among the fraction of open PSⅡ centers，non-photochemical quenching of Chl fluorescence and the maximum quantum yield of PSⅡ in the dark[J]. Plant & Cell Physiology，2009，50（4）：730-43.

[15]Li C，Liu K. Analysis of photosynthesis efficiency of maize hybrids with different yield in the later growth stage[J]. Acta Agronomica Sinica，2002，28.

[16]王立豐，王紀坤. 葉綠素熒光動力學原理及在熱帶作物研究中的應用[J]. 熱帶農業(yè)科學，2013，33（11）：16-23.

[17]尤 鑫，龔吉蕊. 葉綠素熒光動力學參數(shù)的意義及實例辨析[J]. 西部林業(yè)科學，2012，41（5）：90-94.

[18]陳蓮花，劉 雷. 葉綠素熒光技術在藻類光合作用中的應用[J]. 江西科學，2007，25（6）：788-790.

[19]Holzwarth A R，Lenk D，Jahns P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves：Ⅰ. Theoretical considerations[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2013，1827（6）：786-92.

[20]Zhou R，Zhao H. Seasonal pattern of antioxidant enzyme system in the roots of perennial forage grasses grown in alpine habitat，related to freezing tolerance[J]. Physiologia Plantarum，2004，121（3）：399-408.

[21]葛紅星，陳 釗，李 健，等. pH和氮磷比對微小原甲藻和青島大扁藻生長競爭的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學，2017，24（3）：587-595.

[22]雷玉新，劉耀興，席 銀，等. 水體中鐵離子和氮磷比對藻類生長影響研究[J]. 生態(tài)科學，2016（1）：75-78.

[23]李 慧，丁 剛，辛美麗，等. 不同氮、磷濃度及配比對銅藻（Sargassum horneri）幼苗生長的影響[J]. 海洋與湖沼，2017，48（2）：368-372.

[24]陳慶榮，林長順. 氮、磷對青島大扁藻生長的影響初探[J]. 農民致富之友，2017（8）：63-64.

[25]劉東艷，孫 軍，鞏 晶，等. 不同氮、磷比例對球等鞭金藻生長的影響[J]. 海洋水產(chǎn)究，2002，23（1）：29-32.

[26]李 冰. 氮磷營養(yǎng)鹽與藻類生長相關性研究[D]. 濟南：山東建筑大學，2013.

[27]陳書秀，梁 英，王 虎. 氮磷濃度對雨生紅球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響[J]. 淡水漁業(yè)，2012，42（1）：15-19.

[28]王昭玉. 葉綠素熒光參數(shù)對氮、磷限制的響應及其在赤潮生消過程中的變化特征研究[D]. 青島：中國海洋大學，2013.

[29]孫開明. 東海原甲藻光合系統(tǒng)Ⅱ可變熒光對營養(yǎng)鹽變化的響應研究[D]. 青島：中國海洋大學，2015.

[30]許 珍，殷大聰，陳 進，等. 溫度和光強對4種常見水華藻葉綠素熒光特性的影響[J]. 長江科學院院報，2017，34（6）：39-44.