尖孢鐮刀菌誘導產酶及同步糖化發酵產纖維素乙醇

孫曼鈺 李棟梁 舒月力

摘要：以尖孢鐮刀菌為研究對象，探究其誘導產酶及同步糖化發酵產纖維素乙醇的影響。選取不同誘導底物、產酶培養基以及發酵時間，通過測定發酵液中羧甲基纖維素酶活性和木聚糖酶活性，確定最佳誘導產酶條件。最佳誘導產酶培養基：底物30 g/L，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨3 g/L，pH值6.0。最佳誘導產酶的底物為小麥秸稈，發酵4 d羧甲基纖維素酶活性達到12.40 U/mL，木聚糖酶活性達到 930.9 U/mL。尖孢鐮刀菌誘導所產纖維素酶具有較好的pH值穩定性和溫度穩定性，在一定程度上能彌補真菌纖維素酶耐堿性差和細菌纖維素酶活性低的不足。將其作為乙醇發酵菌種進行木質纖維素同步糖化發酵，在3%葡聚糖負荷下，96 h生成乙醇12.23 g/L，乙醇得率為71.81%。將其與釀酒酵母混菌同步糖化發酵，48 h添加木糖利用率最高，96 h生成乙醇19.11 g/L，乙醇得率82.11%。

關鍵詞：尖孢鐮刀菌;纖維素酶;同步糖化發酵;乙醇

中圖分類號： S188+.4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0277-05

木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，占地球總生物量的40%左右，高效、廉價地利用木質纖維素轉化為如燃料乙醇等化工產品，是由石油基向生物基經濟社會轉型的基礎[1]。木質纖維素的主要成分是纖維素、木質素、半纖維素。在植物組織中木質素與半纖維素以共價鍵形式結合，并將纖維素分子包埋其中，形成一種堅固的天然屏障[2]。

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為寡糖和纖維二糖并最終水解為葡萄糖的多組分酶系，廣泛存在于自然界的生物如真菌、細菌、少數動物體內，不同微生物所產纖維素酶系組成差別較大：木霉纖維素酶的β-葡萄糖苷酶活性較低，而黑曲霉纖維素酶的外切葡聚糖酶活性較低[3]。尖孢鐮刀菌具有較高的纖維素酶產量，而且前人對其纖維素分解系統的各個成分有較具體的研究[4]。同時，尖孢鐮刀菌也是一種能夠利用己糖和戊糖發酵生產乙醇的絲狀真菌。此外，它能夠產生大量的纖維素酶和半纖維素酶，使之能夠在深層液體或者固態培養條件下附著在木質纖維素底物上。尖孢鐮刀菌的強致病性與其所產纖維素酶有密切關系。由于植物病原菌通過滲入外細胞層和侵入不同的植物組織而感染宿主，感染期間病原菌會完全破壞細胞壁結構中纖維素等多聚物，對纖維素降解能力很強，因此對該菌纖維素降解系統的研究最初是基于防治的目的。隨著研究的深入，尖孢鐮刀菌的高產纖維素酶的性能逐漸被認識，其所產纖維素酶為胞外酶，且酶系完全[5]。纖維素酶發酵生產過程包括原料預處理、發酵過程2個階段，原料主要包括麩皮、秸稈、酒糟、廢紙漿等[6]。在進行纖維素酶發酵生產時，選擇合適的發酵原料很關鍵。纖維素酶是誘導酶，碳源對菌種的產酶能力影響特別大。同時，培養基和發酵時間對菌種產酶能力也有影響。

同步糖化發酵（simultaneous sacchrification and fermentation，SSF）采用纖維素酶對木質纖維素進行水解，同時加入乙醇發酵菌，使水解與發酵在同一反應器內進行，且酶水解過程中得到的糖類能迅速被微生物利用生產乙醇。由于酶解過程中產生的葡萄糖和纖維二糖會很快積累，會對纖維素酶產生非常顯著的終端產物反饋抑制作用，抑制酶解，使得最終的糖的轉化率降低。同步糖化發酵可以消除纖維素酶受葡萄糖和纖維二糖的終產物抑制，提高纖維素酶解的效果并能降低酶制劑的用量，具有染菌風險小、轉化率高、獲得乙醇濃度較高等優點[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料、試劑與儀器 檸條錦雞兒（以下簡稱檸條）采自內蒙古涼城縣，小麥秸稈采自山東省棗莊市;水稻秸稈采自湖南省永州市。試驗地點為天津科技大學生物工程學院，試驗時間為2017年3—4月，主要試劑包括羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、蛋白胨、酵母提取物、檸檬酸、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸銨、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇。主要儀器：微型植物粉碎機（DF-15），購自溫嶺市林大機械有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS），購自上海申安醫療器械廠;循環水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，購自鞏義市予華儀器有限責任公司;水分儀（MJ33），購自瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司;高效液相色譜（1260LC），購自安捷倫科技（中國）有限公司;恒溫水浴鍋（HH-2），購自常州市凱航儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱（DH-101），購自天津市中環實驗電爐有限公司;超凈工作臺（VS-1300L-U），購自蘇州安泰空氣技術有限公司;恒溫培養振蕩器（ZWYR-D2401），購自上海智城分析儀器制造有限公司;水浴振蕩器（HZS-H），購自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;精密電子天平（MS204S），購自瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司;pH計（Delta 320），購自梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司。

1.1.2 菌種與培養基 尖孢鐮刀菌菌種由天津科技大學生物工程學院應用微生物與酶工程實驗室提供;酵母由筆者所在實驗室提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，若制固體培養基加瓊脂20 g/L，不調節pH值。酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD）：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L，若制固體培養基加瓊脂20 g/L，不調節pH值。發酵產酶培養基A：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨 3 g/L，pH值6.0。發酵產酶培養基B：底物 40 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，氯化鈣0.3 g/L，硫酸鎂 0.3 g/L，磷酸氫二銨 10 g/L，磷酸二氫鈉6.94 g/L，磷酸氫二鈉9.52 g/L，pH值 6.0。

1.2 方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌產酶培養基的確定 在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養4 d，平板中長出的菌絲接種PDA培養基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養2 d，得到菌液。取3 mL菌液分別轉接于發酵產酶培養基A和B，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養。在培養后3、4、5 d分別取發酵液12 000 r/min離心20 min，上清即為粗酶液。

1.2.2 尖孢鐮刀菌產酶誘導底物的確定 選取3種誘導底物，分別為檸條、麥稈和水稻秸稈。以上原料自然風干，剪成2～3 cm小段，用植物試驗粉碎機粉碎，過20 mm篩。用于成分分析的秸稈原料在空氣中干燥至水分低于10%。

在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養4 d，平板上長出的菌絲接種于PDA培養基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養 2 d，得到菌液轉接于發酵產酶培養基A，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養。在培養后3、4、5 d分別取發酵液12 000 r/min離心20 min，上清即為粗酶液。

1.2.3 尖孢鐮刀菌產酶發酵時間的確定 在PDA平板上接種菌絲，28 ℃培養4 d，平板中長出的菌絲接種于PDA培養基中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養2 d，得到菌液。取3 mL菌液轉接于發酵產酶培養基A，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養。在培養后3、4、5 d分別取發酵液12 000 r/min離心 20 min，上清即為粗酶液。

1.2.4 酶活性的測定 酶活性定義[8]：在50 ℃、pH值4.8條件下，1 min內由1 mL酶解液催化底物水解生成1 μg葡萄糖（木糖）所需的酶量，定義為1個酶活性單位，以U/mL表示。

CMC-Na酶活性測定：于試管中加入2 mL由pH值為4.8的檸檬酸緩沖溶液配制的1% CMC-Na，預熱5 min，再向試管中加入0.5 mL粗酶液，對照管中加入底物作空白對照。50 ℃水浴30 min，向試管和對照管中分別加入3 mL DNS，沸水浴10 min，迅速冷卻至室溫，定容至25 mL，混勻，于540 nm下測吸光度。酶活計算公式如下：

x=D×（1/0.5）×n×2。

式中：X為羧甲基纖維素（還原糖）酶活性，U/mL;D為吸光度在標準曲線上查得的還原糖量，mg;1/0.5為換算成酶液 1 mL;n為酶樣的稀釋倍數;2為時間換算系數。

木聚糖酶活性測定[9]：與CMC-Na酶活性測定過程基本相似，將底物換成木聚糖，檸檬酸緩沖液換成pH值為4.4的乙酸-乙酸納緩沖液。于試管中加入2 mL由pH值為5.5的乙酸-乙酸納緩沖液配制的1%木聚糖，預熱5 min，再向試管中加入2 mL經適當稀釋的酶液，對照管中加入底物作空白對照。40 ℃水浴30 min，向試管和對照管中分別加入5 mL DNS，沸水浴10 min，冰浴5 min，定容至25 mL，混勻，于 540 nm 處測吸光度。酶活計算公式如下：

xD=（Da-Db）×K+C0M×t×1 000;

x′=XD×Dt。

式中：xD為稀釋酶液中木聚糖酶的活性，XD值應在0.04～0.10 U/mL 之間;Da為酶反應吸光度;Db為酶空白樣吸光度;K為標準曲線斜率;C0為標準曲線截距;M為木糖的摩爾質量;t為酶解反應時間，min;1 000為轉化因子，1 mmol=1 000 μmol;x′為試樣中木聚糖酶的活力，U/mL;Dt為試樣稀釋倍數。

1.2.5 同步糖化發酵 尖孢鐮刀菌不僅可以誘導產酶，還可以用來進行木質纖維素同步糖化發酵。將麥稈與 0.5 mol/L NaOH溶液按料液比1 ∶ 20（g ∶ mL）混合，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃預處理1 h，固體殘渣水洗至中性，烘干，粉碎，過 20 mm 篩。將上述經NaOH處理后的物料按30 mg/mL葡聚糖固體負荷進行同步糖化發酵，反應體積為100 mL。纖維素酶（celluclast） 1.5 L和β-葡萄糖苷酶用量按照25 FPU/g葡聚糖加入酶解體系中，木聚糖酶按照10 mg/g葡聚糖加入酶體系中，于50 ℃、200 r/min下預酶解6 h。

將酵母接種的時間定義為同步糖化發酵開始起點，按照5%接種量將尖孢鐮刀菌種子液接入降解液中，于35 ℃、150 r/min 下培養120 h。在接種后6、12、24、48、72、96、120 h取樣，樣品12 000 r/min下離心5 min，取上清，用高效液相色譜法測葡萄糖、木糖和乙醇含量。所使用的色譜柱為Aminex HPX-87P（Bio-Rad）有機酸分析柱，5 mmol/L稀硫酸為流動相，使用前經0.22 μm濾膜過濾并超聲脫氣30 min。測定時柱溫60 ℃，流速0.6 mL/min[10]。

2 結果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌產酶誘導底物和培養時間的確定

纖維素酶是誘導酶，碳源對菌種的產酶能力影響很大，不同碳源對纖維素酶的合成有不同的誘導作用，一般天然纖維素原料更有利于纖維素酶的合成。選取水稻秸稈、小麥秸稈和檸條為尖孢鐮刀菌誘導底物，分別在發酵后3、4、5 d取樣測定其羧甲基纖維素（CMC）酶活性和木聚糖酶活性。由圖1可知，木本植物檸條誘導產酶效果遠不如草本植物水稻和小麥秸稈。發酵后4 d水稻秸稈和小麥秸稈的CMC酶活性是檸條的10倍，木聚糖酶活性在300～931 U/mL之間，高于檸條，同時也高于其他文獻研究。葛春輝等從垃圾堆肥中分離出能用羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的降解菌，能產生胞外纖維素酶，最佳酶活僅達到376 U/mL[11]。這是由于不同植物種類中木質素、纖維素、半纖維素的分布和含量不一樣。木本類植物具有較高的纖維素和木質素含量，纖維素以微纖維形式存在，纖維素鏈之間氫鍵相互連接[12]。木質素纏繞在纖維素周圍，且與半纖維素成分緊密相連，共同維持著纖維素的完整性及結構的剛性，這種結構阻礙了微生物與纖維素的接觸。草本類植物中的半纖維素含量較高[13]，內部纖維素結晶結構相對較疏松，所以誘導產酶效果優于木本植物。

對于尖孢鐮刀菌產酶而言，無論是CMC酶活性還是木聚糖酶活性都是發酵后4 d遠高于發酵后3、5 d。

2.2 尖孢鐮刀菌產酶培養基的確定

纖維素酶是誘導酶，碳源對菌種的產酶能力影響特別大。同時，培養基和發酵時間的選擇對菌種產酶能力也有影響。如圖2所示，分別選取水稻秸稈和小麥秸稈為底物，選取A、B、C 3種不同培養基誘導產酶，在發酵后4 d取樣測其CMC酶和木聚糖酶活性。水稻和小麥秸稈誘導下A培養基CMC酶活分別為12.40、10.82 U/mL，木聚糖酶活為930.92、311.49 U/mL;而B培養基中CMC酶活為2.41、3.43 U/mL，木聚糖酶活為158.86、78.65 U/mL;C培養基中CMC酶活為6.23、5.64 U/mL，木聚糖酶活為423.65、145.78 U/mL。本試驗所用3種培養基所產纖維素酶活都要高于其他文獻報道。其中，2種底物誘導下A培養基產酶效果都要優于B、C 2種培養基，由于A培養基中氮源含量高于B種培養基，豐富的氮源有利于尖孢鐮刀菌的生長，同時有利于其產酶。

對于同是草本植物的水稻秸稈和小麥秸稈，水稻秸稈誘導產酶效果明顯優于小麥秸稈。同時，尖孢鐮刀菌誘導產酶具有較好的pH值穩定性和溫度穩定性，尤其對強堿環境的耐受力在一定情況下彌補了真菌纖維素酶耐堿性差和細菌纖維素酶活力不足等缺點。因此，該菌有進一步研究的意義。

2.3 尖孢鐮刀菌同步糖化發酵

根據再生能源實驗室（NREL）2步酸水解法對未處理小麥秸稈和堿處理小麥秸稈進行成分分析，結果表明，纖維素含量由32.73%增加到62.81%，半纖維素含量由22.18%變為22.66%。經過NaOH預處理后，小麥秸稈中纖維素和半纖維素的含量明顯升高，木質素含量明顯降低，表明NaOH預處理去除了秸稈中的大量木質素，從而使得纖維素和半纖維素比例相對升高。有效的預處理方式能提高剩余多聚糖的酶可及性及可利用糖的濃度，從而最終提高乙醇產量[14]。

圖3-a為尖孢鐮刀菌同步糖化發酵葡萄糖利用情況，與傳統發酵菌釀酒酵母相比較，0～12 h內釀酒酵母迅速利用葡萄糖，12 h后基本利用完全;尖孢鐮刀菌試驗組原料繼續酶解，葡萄糖濃度增加;12～48 h，尖孢鐮刀菌開始利用葡萄糖，但是相比于釀酒酵母，其利用周期較長，利用速率較慢;48～96 h基本趨于平穩。

如圖3-b所示，尖孢鐮刀菌對于2種菌的木糖利用率稍高于釀酒酵母。釀酒酵母基本上不利用木糖，釀酒酵母作為傳統的乙醇發酵菌株具有耐受能力強、不易染菌等優點，但是天然的釀酒酵母不具有木糖代謝能力，木糖發酵是利用纖維素類物質生產乙醇的關鍵技術難點之一[15]。24～48 h內尖孢鐮刀菌試驗組木糖濃度由12 h的12.78 g/L降低到6 g/L左右，48 h后基本趨于平穩。但是2種菌的木糖利用率都較低，五碳糖與六碳糖的共利用是目前同步糖化發酵存在的最大問題。對于木糖的利用，目前最常見的手段是通過人工構建木糖代謝途徑和構建可以利用木糖的基因工程釀酒酵母[16]。但研究者發現，即使成功構建木糖代謝途徑，在葡萄糖和木糖共發酵中，釀酒酵母的木糖利用能力仍然很弱[17]。

圖3-c為尖孢鐮刀菌同步糖化發酵乙醇生成情況，釀酒酵母12 h內迅速利用葡萄糖生成乙醇，達16 g/L左右，之后基本趨于平穩;尖孢鐮刀菌生成乙醇周期較長，12～60 h內同時利用葡萄糖和木糖，一部分用于維持菌體自身活力，另一部分用于產乙醇，可生產乙醇12 g/L左右。范金霞等以尖孢鐮刀菌為研究對象，設置不同比例的葡萄糖木糖混合發酵生產乙醇，結果表明，葡萄糖在混合糖中被優先利用[18]。葡萄糖的存在限制了木糖的利用，并且當葡萄糖消耗完，尖孢鐮刀菌對木糖的利用周期較長。雖然尖孢鐮刀菌用于同步糖化發酵不如傳統的釀酒酵母產量高，但其對木糖的利用以及誘導產酶都具有較大的研究意義。Paschos等使用預處理小麥秸稈為原料，由尖孢鐮刀菌生產木質纖維素酶液降解，釀酒酵母F12發酵生產燃料乙醇，減少成本的同時得到較高的乙醇產量[19]。

2.4 混菌培養同步糖化發酵

釀酒酵母作為傳統的乙醇發酵菌株具有耐受能力強、不易染菌等優點，但是天然的釀酒酵母不具有木糖代謝能力，而上述試驗證明尖孢鐮刀菌能利用少量木糖，提高木糖利用率和乙醇生成率。所以，將釀酒酵母和尖孢鐮刀菌共培養進行同步糖化發酵。以堿處理小麥秸稈為原料，在3%葡聚糖負荷下進行同步糖化發酵，在發酵初始階段接入釀酒酵母，分別在發酵24、48、72 h后接入尖孢鐮刀菌，葡萄糖、木糖和乙醇利用情況如圖4所示。圖4-a為葡萄糖利用情況，3種情況下葡萄糖利用情況基本一致，12 h內釀酒酵母基本上將葡萄糖全部利用完。

對于木糖利用情況如圖4-b所示，當葡萄糖存在時，木糖基本不被利用，所以0～24 h繼續酶解，木糖繼續生成;當葡萄糖消耗完全，接入尖孢鐮刀菌，木糖開始逐漸被利用，3個時間段分別接入尖孢鐮刀菌，木糖都會開始被利用，其中，24、48 h時接入木糖利用率稍高于72 h接入，可能是由于發酵后期發酵液中營養成分越來越少，菌種活性降低。尖孢鐮刀菌的接入為起止時間，48 h后基本上不利用木糖。其中，48 h 添加尖孢鐮刀菌試驗組木糖利用率最高，3組試驗中仍有8 g/L木糖未被利用。

圖4-c為乙醇生成情況，前24 h 3組試驗乙醇生成趨勢基本一致，基本達到15 g/L左右;24～96 h，48 h加入尖孢鐮刀菌試驗組乙醇繼續生成，96 h達到19.11 g/L，其他2組乙醇生成量最終達到17 g/L左右。2種菌混合發酵乙醇濃度19.11 g/L高于僅用釀酒酵母進行同步糖化發酵13.75 g/L。2種菌分不同時間段添加避免了菌種之間的拮抗作用[20]，但是由于同步糖化發酵過程會產生一些抑制物如糠醛、甘油等，這些物質會影響尖孢鐮刀菌對木糖的利用，所以，木糖的利用仍是木質纖維素同步糖化發酵的一個難題。

3 結論

纖維素酶是誘導酶，碳源、培養基和發酵時間對菌種的產酶能力影響特別大。本研究對尖孢鐮刀菌誘導產酶底物、培養基以及發酵時間進行分析，確定了水稻秸稈為最佳誘導產酶底物，最佳誘導產酶培養基為：底物30 g/L，CMC-Na 5 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸銨3 g/L，pH值6.0。在發酵后4 d羧甲基纖維素酶活性12.40 U/mL，木聚糖酶活性達到930.92 U/mL。尖孢鐮刀菌同樣用于木質纖維素的同步糖化發酵產纖維素乙醇，可以同時利用葡萄糖和木糖， 木糖利用率達到49.53%，96 h生成乙

醇12.23 g/L。

尖孢鐮刀菌誘導所產纖維素酶具有較好的pH值穩定性和溫度穩定性，在一定程度上能彌補真菌纖維素酶耐堿性差和細菌纖維素酶活性低的不足。在纖維乙醇研究中，2種菌分不同時間段添加，避免了菌種之間的拮抗作用，相比于單一菌種發酵，木糖利用率提高，乙醇濃度由13.75 g/L提高到19.11 g/L。尖孢鐮刀菌雖利用木糖產乙醇周期較長，但是對于利用纖維素類物質和木糖發酵生產乙醇這一難點的解決以及利用基因工程技術培育新的菌株具有重要的研究意義。

參考文獻：

[1]徐麗麗，沈 煜，鮑曉明. 釀酒酵母纖維素乙醇統合加工（CBP）的策略及研究進展[J]. 生物工程學報，2010，26（7）：870-879.

[2]王 敏，王 倩，吳榮榮. 木質纖維素生產燃料乙醇預處理技術研究進展[J]. 衡水學院學報，2010，12（4）：106-109.

[3]韓寒冰，程水明，劉杰鳳，等. 一株產纖維素酶鐮刀菌的篩選、鑒定與酶學性質[J]. 現代化工，2014（7）：61-65.

[4]Amore A，Faraco V. Potential of fungi as category Ⅰ consolidated bioprocessing organisms for cellulosic ethanol production[J]. Renewable & Sustainable Energy Reviews，2012，16（5）：3286-3301.

[5]王 瑋. 尖孢鐮刀菌高產纖維素酶菌株的篩選鑒定及發酵條件優化[D]. 呼和浩特：內蒙古大學，2011.

[6]任恒星，冷云偉，李 浩，等. 纖維素酶生產研究進展[J]. 安徽農學通報，2010，16（15）：63-64，79.

[7]張 強. 干法生物煉制技術生產高濃度纖維素乙醇的同步糖化與共發酵研究[D]. 上海：華東理工大學，2017.

[8]中華人民共和國國家發展和改革委員會. 纖維素酶制劑：QB 2583—2003[S]. 北京：中國標準出版社，2003.

[9]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局. 飼料添加劑木聚糖酶活力的測定 分光光度法：GB/T 23874—2009[S]. 北京：中國標準出版社，2009.

[10]Qin L，Liu Z H，Li B Z，et al. Mass balance and transformation of corn stover by pretreatment with different dilute organic acids[J]. Bioresource Technology，2012，112：319-326.

[11]葛春輝，徐萬里，邵華偉，等. 兩株產纖維素酶芽孢桿菌的篩選及其纖維素酶部分特性[C]//中國土壤學會. 第十一屆全國會員代表大會暨第七屆海峽兩岸土壤肥料學術交流研討會，2008：76-80.

[12]Sticklen M B. Plant genetic engineering for biofuel production：towards affordable cellulosic ethanol[J]. Nature Reviews Genetics，2010，11（4）：308.

[13]Zhao X E，Zhang L H，Liu D H. Biomass recalcitrance. Part Ⅰ：the chemical compositions and physical structures affecting the enzymatic hydrolysis of lignocellulose[J]. Biofuels，Bioproducts and Biorefining，2012，6（4）：465-482.

[14]Brar K K，Kaur S，Chadha B S. A novel staggered hybrid SSF approach for efficient conversion of cellulose/hemicellulosic fractions of corncob into ethanol[J]. Renewable Energy，2016，98：16-22.

[15]Demeke M M，Dietz H，Li Y Y，et al. Development of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrial Saccharomyces cerevisiae strain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering[J]. Biotechnology for Biofuels，2013，6：89.

[16]Zha J，Shen M H，Hu M L，et al. Enhanced expression of genes involved in initial xylose metabolism and the oxidative pentose phosphate pathway in the improved xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae through evolutionary engineering[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2014，41（1）：27-39.

[17]Jin M J，Gunawan C，Balan V，et al. Simultaneous saccharification and co-fermentation （SSCF） of AFEXTM pretreated corn stover for ethanol production using commercial enzymes and Saccharomyces cerevisiae 424A（LNH-ST）[J]. Bioresource Technology，2012，110：587-594.

[18]范金霞，楊 謙，陳忠祥，等. 尖孢鐮刀菌發酵混合糖產乙醇[J]. 東北林業大學學報，2010，38（9）：113-115.

[19]Paschos T，Xiros C，Christakopoulos P. Ethanol effect on metabolic activity of the ethalogenic fungus Fusarium oxysporum[J]. BMC Biotechnology，2015，15：15.

[20]Xiros C，Vafiadi C，Paschos T，et al. Toxicity tolerance of Fusarium oxysporum towards inhibitory compounds formed during pretreatment of lignocellulosic materials[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2011，86（2）：223-230.