維生素預混料中生物素含量的試劑盒法驗證

陳敏兒，黃啟紅，熊 娟，伍玲燕，黃璇瑩，張云龍

(廣東省測試分析研究所，廣東 廣州 51000)

1 原理

生物素是植物乳桿菌Lactobacillus plantarum 生長所必需的營養素，將樣品提取液和生物素檢測培養基加入包被有Lactobacillus plantarum 的微孔中，Lactobacillus plantarum 的生長與樣品生物素的含量呈線性關系。添加生物素作為標準或者作為樣品混合物，乳桿菌會一直生長直至生物素被消耗殆盡。培養一段時間后測定吸光度，根據生物素含量與吸光度的標準曲線計算出樣品中生物素的含量。

2 測定方法

2.1 試劑和材料

微生物法定量檢測生物素試劑盒(VitaFast)

氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)

生物素標準品(中國藥品生物制品檢定所)

一次性無菌注射器(江南)

0.22μm無菌過濾器(Sartorius stedim)

2.2 儀器和設備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)

BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化)

1900培養箱(BioCELL)

MK3酶標檢測儀(Thermo)

JJ200B電子天平(G&G)

2.3 供試品溶液的制備：

稱取1.000g維生素預混料到1000mL容量瓶中，加入約400mL蒸餾水，搖勻。用NaOH調整pH值到8.0±0.2。95℃水浴提取30分鐘，其間振蕩至少5次，迅速冷卻到30℃以下。用無菌蒸餾水準確定容至刻度。取1mL溶液至一個50mL無菌離心管中,加無菌蒸餾水至40mL，然后搖勻。無菌過濾，根據濃度范圍，在1.5mL(或2.0mL)無菌試管中進一步稀釋。

2.4 培養基的制備

取出試劑盒中的培養基，打開瓶蓋用鑷子取出干燥劑，加入10mL無菌水(取自試劑盒)至生物素培養基瓶中。蓋好培養基瓶，搖勻。水浴加熱該瓶至95℃保持5min分鐘，其間振蕩至少2次，并確保瓶子封閉。迅速冷卻至室溫(30℃以下)。使用0.2μm無菌濾膜過濾培養基至無菌離心管中。

2.5 標準品溶液的的制備

打開試劑盒中的生物素標準品瓶，添加X mL(X=詳見標準品瓶)無菌水(取自試劑盒)至標準品瓶中。蓋上標準品瓶蓋，搖勻稀釋=標準品濃縮液。取6個無菌管(1.5～2.0mL)，并按照下列表格準備標準品溶液：

*樣品提取稀釋倍數1∶40已經包含在標準曲線中。

表1 標準曲線溶液制備

2.6 測定法

微孔板實驗中必須使用無菌水稀釋的無菌樣品，無菌水取自試劑盒。

移液器先移取培養基，之后標準品或稀釋的樣品，如下：

-移取150μL生物素培養基至微孔中。

-移取150μL標準品或稀釋的樣品至指定的微孔中(用標準品或樣品溶液沖洗移液器尖)。

-用粘合箔蓋住板條或微孔：除去粘合箔上的保護層，將其平放在微孔條上，用手將粘合箔平壓，使其充分封閉微孔板條。注意保證粘合箔和微孔的封閉性，特別注意微孔的邊緣部分。

-在37℃黑暗條件下孵育44～48h。

測量：

-再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振蕩，使微生物溶解在培養基中。

-將微孔板翻回如前置于桌面上，從右上角開始以對角線方向180°角輕扯下粘合箔，與此同時務必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔與微孔板粘合過緊而在撕扯時帶起微孔板。

-破壞微孔中液體表面的所有泡沫(可以用移液管尖或針狀物)。

-用酶標儀610～630nm(或540～550nm)條件下讀取吸光度。

計算：

在計算結果時使用拜發公司提供的配套的RIDA?SOFTWin軟件。

判定檢測結果有效：

-OD空白值

-OD標準5>0.6 OD

樣品稀釋倍數40已經包括在標準曲線中(詳見質量保證書)。在下面的公式中，只需要考慮提取的進一步稀釋倍數及不同的樣品重量。

生物素(μg / 100g)=

3 方法驗證

3.1 專屬性

空白溶液的制備：不加樣品，依2.3所述處理得相應的生物素空白溶液；

陰性樣品溶液：選取不含添加生物素的樣品，依2.3制備的陰性樣品溶液；

供試品溶液：依2.3制備；

測定：按2.6所述測定法測定空白溶液和樣品溶液的吸光度。

所得結果如下：

表2 專屬性試驗結果

3.2 線性

依2.5配制濃度為0.08μg/100mL，0.24μg/100mL，0.40μg/100mL，0.56μg/100mL，0.72μg/100mL的生物素標準品溶液，按2.6所述在630nm波長處測定，所得濃度與吸光度關系如下：

表3 線性試驗標準曲線

3.3 精密度

3.3.1 重復性

依2.3的方法平行制備6份供試品溶液，分別測定供試品溶液中生物素的濃度，以所得的樣品中生物素的濃度來計算RSD %。

所得結果如下：

表4 重復性試驗結果

3.3.2 中間精密度

連續3日，每日分取同一批號的樣品，由不同檢測員按2所述方法測定生物素，以測得的樣品中生物素的結果來計算相應的RSD。

表5 中間精密度試驗結果

3.4 準確度

取已知生物素含量的樣品1.000g，置離心管中，共取9份，3份為一組，分為A、B、C三組。各組對照品加入量與樣品生物量之比分別約為0.8∶1,1∶1，1.2∶1。

A組：3份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入53.0μg生物素對照品(配制濃度為100μg/mL的生物素對照品溶液，加入此溶液0.530mL)，搖勻，依2.3處理，作為供試品溶液A。按2.6所述測定，計算回收率和RSD。

B組：3份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入66.0μg生物素對照品(配制濃度為100μg/mL的生物素對照品溶液，加入此溶液0.660mL)，搖勻，依2.3處理，作為供試品溶液B。按2.6所述測定，計算回收率和RSD。

C組：3份樣品均同法處理，方法為：于樣品中加入79.0μg生物素對照品(配制濃度為100μg/mL的生物素對照品溶液，加入此溶液0.790mL)，搖勻，依2.3處理，作為供試品溶液C。按2.6所述測定，計算回收率和RSD。

所得結果如下：

表6 準確度試驗結果

備注：測得加入生物素的質量(μg)=測得總的生物素的質量(μg)-1.000g樣品生物素的質量(μg)
回收率(%)=測得加入生物素的質量(μg)÷加入生物素的質量(μg)×100%

3.5 耐用性

取同一樣品溶液，分別于0、1、2、3、5、8小時時測定，測得生物素含量(mg/100g)，計算RSD。

表7 耐用性試驗結果

4 結論

本文選取維生素預混料為樣品，參照《中國藥典》2015版四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則，對生物素微生物試劑盒法進行方法學驗證，驗證實驗中線性和專屬性試驗測試結果良好，重復性相對標準偏差(RSD)為2.57%，中間精密度RSD為1.73%，準確度試驗中回收率在95%～110%之間，RSD分別達4.37%、4.99%、2.51%，耐用性RSD為2.13%，均符合指導原則中的要求(RSD≤6%，回收率在80%～115%之間)。結果表明，生物素試劑盒法準確，可靠，適合于該維生素預混料中生物素的檢測要求。與生物素傳統微生物法相比，生物素試劑盒法方便快捷，無需活化菌種及傳代，省時省力，亦減少污染概率，更適合廠家用于監控產品質控。