膜芯片技術對牛、羊、牦牛、驢肉源食品的摻偽鑒別

任易婕 霍勝楠 翟清燕 孫瀟慧 劉菲 李文靜

摘 要：采用膜芯片技術，通過對牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬11 種目標物種的檢測，實現對牛、羊、驢、牦牛物種的摻偽鑒別。結果表明：該方法具有良好的特異性和適用性，檢測靈敏度和摻偽靈敏度均可達到0.1%，能快速、準確地同時鑒別牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬11 種動物源性成分，可滿足肉類食品樣品中對牛、羊、牦牛、驢等摻偽鑒別的檢驗需求。

關鍵詞：膜芯片技術;高通量;動物源性成分;肉類;摻偽鑒別

Abstract： A membrane chip technology to detect 11 target animal species including cattle， sheep， donkey， yak， chicken， duck， rabbit， mink， fox， mouse and pig was developed in order to identify adulteration in beef， mutton， donkey and yak meat products. Our experimental results showed that the method had good specificity and applicability. The method sensitivity and its sensitivity in detecting adulterated meat samples were both up to 0.1%. This method could quickly and accurately identify 11 animal origin components of cattle， sheep， donkey， yak， chicken， duck， rabbit， mink， fox， mouse and pig， and could meet the requirements for the identification of adulteration in beef， mutton， yak and donkey meat samples.

Keywords： membrane chip technology; high throughput; animal-derived constituents; meat; adulteration identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081

中圖分類號：TS251.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）06-0033-06

引文格式：

任易婕， 霍勝楠， 翟清燕， 等. 膜芯片技術對牛、羊、牦牛、驢肉源食品的摻偽鑒別[J]. 肉類研究， 2019， 33（6）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081.? ? http：//www.rlyj.net.cnREN Yijie， HUO Shengnan， ZHAI Qingyan， et al. Application of membrane chip technology in the identification of adulteration in beef， sheep， yak and donkey meat[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 33-38. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190417-081.? ? http：//www.rlyj.net.cn

近年來，隨著我國經濟發展日益迅速，我國食品產業也進入飛速發展的黃金時期，民眾對于多種肉類的需求也逐漸上升。然而食品安全問題層出不窮，給整個食品行業和廣大消費者造成很大的影響。驢肉因口感好、脂肪含量低、營養價值高等特點，受到越來越多消費者的青睞[1]，但其產量低、價格高，時有摻假情況發生[2-3]。牦牛是一種產自西部地區的特色畜類動物，牦牛肉氨基酸比例均衡，脂肪含量很低，可作為優質蛋白質的肉質來源[4]，但其市售價格遠高于其他肉制品，摻偽現象時有發生[5-6]。常見的市售加工牛肉、羊肉，如羊肉串、肉干、肉丸等，也常有被摻假的可能性，甚至被不法商販摻入低價的豬肉、雞肉、鴨肉甚至狐貍肉[7-8]。有文獻報道指出，在抽檢的預包裝與散裝牛肉制品中，分別有2 批次和5 批次檢出非牛源性成分[9]。北京地區對牛羊肉進行篩查后，發現其存在摻入鴨肉、雞肉、豬肉的比例高達34.9%[10]。驢肉、牦牛肉、牛肉、羊肉的摻偽時有報道，因此，對上述肉制品進行摻偽鑒別成為廣大民眾與食品檢測的需求。但在對肉制品進行動物源性成分篩查時，同一份樣品往往需要同時開展多種可疑摻假動物源性成分的檢測，工作量較大，對于大批量的肉制品篩查需要花費較長的時間及較多的人力物力。此外，對于某些由多種肉制品加工而成的肉制品來說，單重鑒別方法顯得效率低下。因此，建立一種高通量的針對多種動物源性成分的檢測方法迫在眉睫。

目前，動物源性成分檢測技術有很多，包括基于代謝組學的檢測方法、基于蛋白質的檢測方法和基于核酸的檢測方法等[11-12]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術由于其靈敏度高、特異性好，且引物探針設計簡單，成為目前應用度最高的動物源性成分檢測技術[13-15]。PCR方法包括普通PCR技術、實時熒光PCR技術和數字PCR技術等[16-17]。目前在PCR技術中，熒光PCR方法應用最為廣泛[14，18-20]，也是很多動物源性成分檢測標準中的常用方法。盡管傳統的動物源性成分分子生物學檢測技術具有很多優點，但在樣本量大、高效、快速的檢驗要求下，不能很好地滿足檢驗需求。且現有分子生物學檢測技術對實驗室儀器、環境條件、人員技術等要求較高，因此僅適用于實驗室檢驗，不適用于大規模、高通量篩查工作的需求，無法滿足當前食品安全監督、監管的要求。因此，需要建立新的方法來進行動物源性成分的高通量、多指標檢測。

膜芯片檢測方法是核酸雜交技術發展的產物，該方法利用反向斑點雜交原理，將一組寡核苷酸探針順序排列于支持膜表面，形成一系列低密度膜芯片探針陣列。利用多重PCR技術將待檢測目標基因進行擴增后，擴增產物經過變性后形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交，經底物顯色形成可視化的檢測結果。1992年，膜芯片技術被Fiss等[21]用來檢測分枝桿菌，隨后被應用到食品微生物檢測[22-23]、轉基因篩查[24-26]、動物醫學[27-28]及生物科學[29-30]等眾多領域。由于可視化芯片一般將多個靶位點同時固定在芯片上，因此可同時檢測多個目的基因。與傳統PCR方法相比，膜芯片檢測方法具有檢測通量高、檢測周期短、成本低廉、結果可靠等技術優勢，可作為一種高通量動物源性成分檢測方法加以利用。本研究設計了一種膜芯片方法，可快速鑒別驢肉、牦牛肉、牛肉、羊肉中是否有雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬等肉源成分的摻偽，為肉源性成分檢測提供了良好思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從濟南市場及購物網站購買各種肉類樣本，包括牛、羊、驢、雞、鴨、豬等生鮮樣本及各種加工肉制品（牛肉干2 份、牦牛肉干1 份、醬驢肉2 份、羊肉串1 份）。牦牛、兔、貂、狐、鼠、貉、馬、水牛、狗、魚等材料為本實驗室儲存樣本。

肉及肉制品核酸提取試劑盒為德國凱杰公司產品;其余化學試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

AB proFlex PCR儀 美國Thermo公司;5424R小型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific有限公司;QuantStudio7 Flex實時熒光PCR儀 美國ABI公司;HL-2000紫外交聯儀 美國思博明科學器材公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針設計利用Primer Premier 5.0軟件設計11 種動物源性成分及內參18S rRNA引物，同時設計可通過堿基互補配對與DNA產物結合的特異性探針。反向引物的5末端用生物素Biotin修飾，引物可擴增出長度為100～200 bp的帶有生物素標記的PCR產物。探針5端連接有6 個碳原子作為連接臂的氨基修飾，用來將探針固定在膜芯片上。同時設計對照探針PC及NC，用來監測雜交過程是否正常。設計5端用生物素修飾、可與PC探針互補的陽性寡核苷酸單鏈（CPC），用于質控膜芯片雜交過程。11 種動物源性成分及內參的引物探針序列如表1所示。

1.3.2 樣品制備

取100 g肉源樣本，經四分法縮分后，進行冷凍研磨，于-20 ℃保存備用。

1.3.3 DNA提取及濃度測定

取50 mg研磨后的樣本，加入1.5 mL離心管中，參照試劑盒方法進行DNA提取。

1.3.4 多重PCR擴增及變性

參照普通PCR反應體系，加入11 種引物，進行多重PCR擴增。多重PCR反應體系中，體系總體積為50 μL，各物質的終濃度分別為：MgCl2 1.5 mmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP均為0.2 mmol/L，UNG酶1 U/50 μL，Taq酶2 U/50 μL，每條引物終濃度0.2 μmol/L。分別用來自11 種動物的基因組DNA為陽性對照，用不含這11 種動物成分的DNA為陰性對照，水為空白對照，作為PCR擴增系統和膜芯片雜交反應的質量控制。PCR反應參數：37 ℃、10 min，1 個循環;95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個循環;72 ℃、10 min，1 個循環。產物變性：將多重PCR產物進行退火變性，以保持單鏈狀態。變性過程為95 ℃、5 min，4 ℃、10 min。退火后單鏈狀態的DNA需立即置于低溫狀態下。

1.3.5 膜芯片檢測

1.3.5.1 11 種動物源性成分的膜芯片設計

將正方形尼龍薄膜分成16 個小區域，將探針根據圖1中的表面設計固定在不同區域。可根據不同點陣的顯色情況判斷是否有該物種源性成分檢出。

1.3.5.2 膜芯片手動雜交過程

手動雜交主要包括去活化、雜交、酶聯、顯色和讀取結果等幾個主要步驟：去活化是將沒有固定在膜上的探針的活性基團封閉，從而增加膜芯片的特異性;雜交過程是通過已固定在膜上的探針將待測PCR產物中的目的基因片段捕獲;酶聯中使用的標記是堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，而PCR產物中目的基因片段帶有生物素標記，如果PCR產物含有目的片段，通過生物素與鏈霉親和素的作用可以將堿性磷酸酶連接到膜上;顯色是通過酶與對應底物發生的變色反應來指示膜上是否有堿性磷酸酶，從而間接指示待測PCR產物中是否含有目的基因片段，從而判定樣品中是否含有目標動物源成分[21-23]。

將膜芯片置于雜交盒內，按表2進行手動雜交。雜交過程在紫外交聯儀中進行，可采用同等實驗效果的儀器。

由圖2可知，牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、豬、貂、狐、鼠在探針所在位置有特異性雜交斑點，內參和陽性對照位置雜交斑點顯色正常，陰性對照及其他位置無雜交顯色斑點。a～f分別表示貉、馬、水牛、狗、魚、貓特異性檢測結果。

由圖3可知，芯片上貉、馬、水牛、狗、魚、貓物種沒有異常雜交點顯示，且各種對照位置均顯色正常，無其他物種的雜交顯色斑點。結果表明，該膜芯片對牛、羊、驢、牦牛、雞、鴨、兔、豬、貂、狐、鼠11 種物種具有良好的特異性，膜芯片上不具有的物種無特異雜交斑點產生。

2.2 11 種肉源成分檢測靈敏度實驗

本研究以牛、羊、牦牛、驢為例，驗證該膜芯片方法的靈敏度。將提取的牛、羊、牦牛、驢的DNA與雞、鴨混合DNA充分混勻，分別制備質量分數為5.0%、1.0%和0.1%的混合模板。按照方法中的操作，進行多重PCR擴增及雜交實驗。

由圖4可知，在5.0%、1.0%和0.1%的混合比例下，牛、羊、牦牛和驢與雞、鴨的混合DNA在膜芯片上均有顯色反應，各對照位置均顯色正常，在雞、鴨的顯色位點上有雜交顯色斑點，說明在質量分數5.0%、1.0%和0.1%條件下，該方法可檢出牛、羊、牦牛、驢成分。實驗結果表明，該方法對牛、羊、牦牛、驢成分具有良好的檢測靈敏度，其檢測下限可達到0.1%。a～d分別表示牛、羊、驢、牦牛成分的靈敏度檢測結果;下腳標1～3. 質量分數為5.0%、1.0%和0.1%的混合模板。摻偽比例為0.1%;a～e分別表示摻入兔、豬、貂、狐、鼠成分的靈敏度檢測結果。

此外，進行摻偽物種靈敏度檢測。分別將兔、豬、貂、狐、鼠DNA與雞、鴨混合DNA充分混勻進行雜交實驗。由圖5可知，在0.1%摻偽比例下，兔、豬、貂、狐、鼠成分在膜芯片上均有顯色反應，各對照位置均顯色正常，在雞、鴨的顯色位點上有雜交顯色斑點，說明在質量分數5.0%、1.0%和0.1%條件下，該方法可檢出兔、豬、貂、狐、鼠成分，表明該方法具有良好的摻偽檢測靈敏度，方法檢出限可達0.1%。

2.3 牛、羊、牦牛、驢成分檢測適用性驗證實驗

為檢驗膜芯片法的實際應用效果，從市場上購買6 份加工肉制品樣品，包括牛肉干2 份、牦牛肉干1 份、驢肉2 份及羊肉串1 份。各待測樣品按照實驗方法中所述進行PCR擴增和芯片雜交實驗，每種樣品重復測定2 次，同時進行熒光方法驗證。豬、牛、羊靶點檢測采用SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法》中的熒光方法進行驗證;驢靶點檢測采用SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實時熒光PCR法》進行驗證，馬靶點檢測采用N/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR》進行驗證，牦牛成分檢測采用SN/T 4397—2015《出口食品中牦牛源性成分的檢測方法 實時熒光PCR法》進行驗證。

由表3可知，芯片顯色結果為各質控對照檢測結果正常，6 份市售樣品中有2 份樣品與標簽不一致，其中牦牛肉干未檢出牦牛源性成分，但檢出豬成分，一份驢肉樣品未檢出驢源性成分，但檢出馬源性成分，剩余4 份樣品與產品配料表中標注成分一致。通過熒光驗證發現，6 份市場樣品膜芯片法檢測結果與熒光驗證結果一致，表明該方法對于牛、羊、牦牛、驢源性成分的檢測具有良好的適用性，可用于包含上述4 種肉源成分的各種肉質樣品檢測。

3 結 論

本研究設計了一種可以高通量鑒別11 種動物源性成分的膜芯片方法，通過對目的肉源性成分進行DNA提取、多重PCR擴增并雜交后，對牛、羊、牦牛、驢源性成分進行特異性、靈敏度與適用性驗證。結果表明，該方法特異性良好，牛、羊、牦牛、驢源性成分的摻偽靈敏度可達到0.1%，且檢驗結果與熒光PCR結果相一致，可快速檢測出牛、羊、牦牛、驢樣品中是否含有雞、鴨、兔、貂、狐、鼠、豬源性成分。生鮮肉和加工肉制品檢驗結果與國標方法相一致，可滿足適用性要求。與熒光PCR方法相比，其高通量、高效率的特點縮短了檢驗所需時間與人力，能夠充分滿足市場監管和日常檢驗的需求。

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