miR-206靶向調控CXCR4對人牙髓干細胞遷移能力的影響

王獻剛 馮保靜

牙髓組織中含有未分化的間充質細胞，Gronthos等[1]發現其具有較強的增殖能力及多向分化能力，便提出了牙髓干細胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)的概念。DPSCs因其來源廣泛、免疫原性低，目前被認為是口腔組織工程中最具潛力的種子細胞[2,3]。牙髓干細胞位于血管周圍的干細胞龕內[4]，當牙髓受到齲壞、磨耗、炎癥等刺激時牙髓干細胞大量增殖并遷移至受損部位，繼而分化為成牙本質細胞，形成修復性牙本質，在牙髓損傷修復過程中發揮重要作用[5]。因此，探索牙髓干細胞遷移能力的機制對牙髓組織的損傷修復具有重要意義。CXCR4作為SDF-1的特異性受體蛋白，參與細胞遷移、侵襲和粘附等多種生理功能，研究顯示SDF-1α/CXCR4信號軸對hDPSCs遷移具有十分重要的調控作用，阻斷或沉默CXCR4表達可顯著抑制hDPSCs的遷移能力[6]。

MicroRNA(miRNA，miR)能通過沉默復合體miRISC(multiprotein RNA induced-silencing complex)與靶 mRNA 3-UTR(3'-untranslated region)結合從而抑制靶mRNA的翻譯，進而調節細胞內多種功能[7]。miR-206是microRNAs家族中的一員，其廣泛參與干細胞和腫瘤細胞的增殖、遷移、分化等[8,9]。研究報道 miR-206可靶向Hmgb3、TRAF6調控影響干細胞的成肌向分化及遷移能力[10,11]。抑制miR-206表達可顯著抑制Propofol誘導的胚胎干細胞的凋亡[12]，但miR-206是否參與調控hDPSCs的生物學特性尚未明確。

本實驗通過在hDPSCs中轉染miR-206 inhibitor和miR-206 mimics，檢測對hDPSCs遷移能力的影響，同時分析、驗證miR-206作用的靶基因，探討miR-206調節hDPSCs遷移的機制，為進一步探索hDPSCs在牙髓損傷修復中的應用提供理論基礎。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 鏈霉素、青霉素、胎牛血清、0pti—MEM(Gibco，美國)；α-MEM培養基、胰蛋白酶(Hyclone，美國)；Transwell小室、六孔培養板(Costar，美國)；酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK，美國)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；細胞孵箱(Heraeus，德國)；離心機(Eppendorf，德國)；miR206 mimics、過表達CXCR4質粒(銳博生物，中國；CXCR4抗體(Abcam公司，英國)；Lipofectamine2000(Invitrogen，美國)。

1.2 正常和牙髓炎牙髓組織的獲取及分離 經醫院倫理委員會批準(本實驗的倫理批準號為：AYLY201806001)，患者知情同意下，收集18～30歲即刻拔除的正常狀態及牙髓炎狀態的智齒各6顆，從釉牙骨質界下1mm左右截斷后取出冠髓，經液氮速凍后提取各組牙髓組織RNA，按試劑盒逆轉錄為cDNA，q-RCR檢測不同狀態下miR-206和CXCR4 mRNA水平的表達情況。

1.3 細胞培養及轉染 收集18～24歲志愿者即刻拔除的前磨牙或第三磨牙，無菌條件下輕輕分離出牙髓組織，1.5mL無菌EP管中剪成1mm3的組織塊；加入4mg/L I型膠原酶500μL消化45min，用含10%胎牛血清的α-MEM培養液重懸后將組織塊接種于35mm皿中，于37℃、二氧化碳孵箱內培養，待細胞從組織塊周圍爬出并長至80%融合率時，采用有限稀釋法挑選單克隆，擴大培養后用于后續實驗。

將處于對數生長期的P3牙髓干細胞消化后，以2×105個/孔接種于6孔板中，分為miR206 mimics、miR206 inhibitor和 miR206對照組(miR206-NC)，miR-206 inhibitor+CXCR4 沉默組(miR-206+si-CXCR4)、miR-206 inhibitor+CXCR4沉默對照組組(miR-206+si-NC)，參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說明書分別對牙髓干細胞進行轉染，轉染48h后通過qRCR檢測miR206轉染效果。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(q-RCR)檢測mRNA的表達 q-PCR檢測轉染后各組細胞miR206和CXCR4 mRNA表達水平。將處于對數生長期的P3牙髓干細胞消化后，以2×105個/孔接種于6孔板中，miRNA轉染后48h，提取miR206 mimics、miR206 inhibitor和對照組細胞的總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara生物技術公司)說明書逆轉錄合成cDNA，儲存于-20℃條件下備用。q-PCR反應根據SYBRRPremix Ex TaqTM(Takara生物技術公司)說明書操作，miRNA-206上游引物為：5’-ATCCAGTGCG TGTCGTG-3’，下游引物為：5’-TGCTTGGAA TGTAAGGAAG-3’；內參U6上游引物為：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物為：5’-AACGCTTCACGA AT T TGCGT-3’；CXCR4上游引物為：5’-GGATGAGGACACTGCTGTA GAG-3’，下游引物為：5’-CTCCTCTTTGTCA TCACGCTTCC-3’；內參β-actin上游引物為：5’-AAAGACCTGTA CGCCAACAC-3’，下游引物為：5’-GTC ATACTCCTGCTTGCTGAT-3’。

1.5 Western blotting檢測hDPSCs中CXCR4蛋白的表達 將處于對數生長期的P3牙髓干細胞消化后，以2×105個/孔接種于6孔板中，miRNA轉染后48 h，PBS漂洗細胞3次，各加入80μL RIPA蛋白裂解液，在冰上提取細胞總蛋白后加入蛋白上樣緩沖液變性，制備10%SDS-PAGE凝膠，每孔加入10μL總蛋白，經電泳分離蛋白、轉膜、5%脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人CXCR4(1∶1000稀釋)、GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體，于4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入對應二抗室溫孵育1h；使用ECL化學發光。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以CXCR4/GAPDH表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 miR-206對hDPSCs遷移能力的影響Transwell遷移實驗檢測miR-206對hDPSCs遷移能力的影響：在24孔板Transwell小室的下層加入600μL培養液，取轉染后各組細胞，無血清的a-MEM重懸，調整細胞懸液密度為5×104/mL，以150μ/孔接種于24孔板Transwell培養小室的上層，細胞培養箱中繼續孵育24h；每組設3個復孔；24h后，小心取出Transwell小室，吸凈小室內培養液，用PBS輕輕洗3遍，將Transwell小室轉移至另一個24孔板中，加入適量40g/L多聚甲醛，室溫固定20min后去除多聚甲醛，PBS漂洗3次，用小棉簽輕輕擦去Transwell小室基底膜上層細胞，然后把Transwell小室移入1g/L結晶紫染色液中，染色20min后吸棄染液，用雙蒸水洗滌小室3次，倒置顯微鏡下觀察細胞遷移的情況，隨機選取視野拍照，并統計遷移細胞的數量。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 miR-206利用生物信息學預測網站進行靶基因預測，預測結果發現CXCR4為miR-206的靶基因，為了確定miR-206靶向結合與 CXCR4的 3’UTR區，將 CXCR4 mRNA突變型(CXCR4-MUT)和野生型(CXCR4-WT)3’UTR合成，并連接到psiCHENK-2載體質粒。將處于對數生長期的P3牙髓干細胞消化后，以2×105個/孔接種于6孔板中，在牙髓干細胞中共轉染miR206-NC、miR206 mimics和CXCR4質粒，轉染48h后，裂解、收集細胞，檢測海腎和螢火蟲熒光素酶熒光強度并進行分析。

1.8 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05表示具有統計學意義。

2.結果

2.1 牙髓炎、正常牙髓組織和hDPSCs中miR-206和CXCR4的表達 qPCR檢測牙髓炎、正常牙髓組織和hDPSCs中miR-206和CXCR4 mRNA的表達水平，結果顯示，與對照組相比，炎癥牙髓組織和hDPSCs中miR-206的表達水平均顯著下調(圖1A)，而CXCR4的表達水平均明顯升高(圖1B)，差異有統計學意義，結果與文獻報道相一致[12,13]。

圖1 牙髓炎、正常牙髓組織及牙髓干細胞中miR-206和CXCR4的表達

2.2 miR-206對牙髓干細胞的遷移能力的調控 Transwell小室實驗檢測hDPSCs遷移能力，結果顯示：miR206-NC組、miR-206 inhibitor組和miR-206 mimics組遷移的細胞數目分別為(67±13個)(144±18個)和(38±6個)，miR-206 mimics組遷移的細胞數目明顯少于對照組，而miR-206 inhibitor組則顯著多于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖2A,B)。

圖2 miR-206調控牙髓干細胞的遷移能力(×10)

2.3 miR-206對CXCR4 mRNA和蛋白表達的影響 qPCR和Western blot檢測沉默和過表達miR-206后CXCR4 mRNA和蛋白表達水平，相對于對照組，miR-206 mimics組mRNA和蛋白的表達水平均顯著下調，而miR-206 inhibitor組則明顯多于對照組，差異有統計學意義(圖3A,B,C,D)。

圖3 miR-206對牙髓干細胞中CXCR4 mRNA和蛋白表達水平

2.4 miR-206的靶基因為CXCR4 通過生物信息學網站預測發現CXCR4是miR-206的潛在靶基因，結果顯示，miR-206 mimics組中的CXCR4 mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組(圖3)，CXCR4和miR-206的表達趨勢相反，說明CXCR4可被miR-206負向調控。為了進一步證明CXCR4是miR-206的靶基因，采用雙熒光素酶報告基因實驗，檢測結果顯示，CXCR4-WT+miR-206 mimics組的熒光比值明顯小于CXCR4-WT+miR-NC組，差異有統計學意義(圖4B)(P＜0.05)。 CXCR4-MUT+miR-206 mimics 組和CXCR4-MUT+miR-NC組的熒光比值分別為0.960±0.052和1.0±0.095，兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05)。以上數據說明miR-206可與CXCR4的3’-UTR區上的位點結合，miR-206與CXCR4存在直接負向調控關系。

圖4 雙熒光素酶報告驗證CXCR4為miR-206靶基因

2.5 沉默CXCR4能夠逆轉miR-206 inhibitor對牙髓干細胞遷移的促進作用 為了進一步研究miR-206和CXCR4的關系，本研究在DPSCs中同時轉染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA，分析共轉染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA對牙髓干細胞的遷移能力的影響。結果顯示，共轉染miR-206 inhibitor和CXCR4 si-RNA能夠逆轉miR-206 inhibitor對CXCR4的表達促進(圖5A，B所示)。共轉染48h后采用Transwell實驗檢測牙髓干細胞的遷移能力。結果顯示，miR-206 inhibitor+CXCR4對照組(miR-206+si-NC)和miR-206 inhibitor+CXCR4 si-RNA組(miR-206+si-CXCR4)的遷移細胞數分別(176±17)個和(110±10)個(圖 5C，D)，與 miR-206 inhibitor+CXCR4對照組相比，miR-206 inhibitor+CXCR4 si-RNA組遷移細胞數顯著減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。說明沉默CXCR4的表達能夠逆轉miR-206 inhibitor對牙髓干細胞的遷移的促進作用。

圖5 沉默CXCR4可部分逆轉miR-206 inhibitor對牙髓干細胞遷移能力的抑制作用(×10)

3.討論

DPSCs位于牙髓中血管周圍的干細胞龕[4]，一般情況下，其在牙髓中不增殖、分化和遷移，保持未分化的間充質細胞狀態。當牙髓-牙本質復合體受到齲壞、磨耗等病理性損害時，DPSCs可迅速增殖、遷移至受損部位[14]，分化為成牙本質細胞形成修復性牙本質隔離外界刺激并修復受損組織。細胞遷移是組織損傷修復的關鍵步驟，干細胞可大量增殖并遷移至損傷部位，通過直接分化為與組織修復相關的細胞類型或者通過誘導周圍環境中的多種生長因子進行組織修復。本研究首次探索了miR-206對hDPSCs遷移能力中的影響，研究結果顯示抑制miR-206表達后可促進hDPSCs的遷移能力，而抑制miR-206表達可上調CXCR4 mRNA和蛋白的表達，兩者的表達呈負相關；而過表達miR-206表達則結果相反。檢測正常和牙髓炎狀態下牙髓組織和牙髓干細胞中的miR-206和CXCR4的表達時，發現炎癥牙髓組織和牙髓干細胞中miR-206的表達水平顯著下調，而CXCR4的表達水平明顯升高，結果與文獻報道相一致[13]。MicroRNA作為一類非編碼單鏈RNA分子，在動植物中廣泛參與細胞轉錄后基因表達調控，在調控干細胞增殖、遷移和分化方面發揮重要作用，參與調控干細胞組織損傷修復過程。研究表明miR-206可通過調控多種靶基因，如Hmgb3、Pim-1，進而調控細胞的生存、增殖及遷移能力[9,10]。MiR-206還可通過PTEN/AKT/mTOR信號通路抑制頭頸鱗狀細胞癌的遷移能力[15]。細胞的遷移過程由多種細胞趨化因子和信號通路的相互作用調控的結果。例如，SDF-1α/CXCR4可誘導骨髓間充質干細胞遷移至內皮細胞[16]；同時研究顯示SDF-1α/CXCR4信號軸可通過FAK/PI3K/AKT/β-catenin信號通路調控hDPSCs的遷移能力[6]。綜上，干細胞的增殖及遷移能力在組織損傷修復中發揮重要作用。本實驗結果顯示牙髓炎癥狀態下miR-20和CXCR4的表達呈負相關，進一步實驗表明miR-206可調控hDPSCs的遷移能力及CXCR4的表達，說明在牙髓炎損傷修復過程中miR-206在hDPSCs遷移過程中發揮重要調控作用。

MicroRNAs(miRNAs)從一種約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成小分子RNA，約21-23個堿基大小，miRNAs在結構上不同于雙鏈結構的siRNA，其機制也與siRNA介導的mRNA降解有所區別，microRNA-RISC復合體對mRNA靶基因的作用主要取決于其與靶基因轉錄本序列互補的程度。本實驗中miR-206與CXCR4序列高度互補，并通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-206與CXCR4靶向結合導致CXCR4 mRNA發生降解，進而影響CXCR4蛋白的表達。

本研究探索了miR-206對hDPSCs遷移能力中的影響，通過雙熒光素酶報告實驗證實了miR-206結合與 CXCR4的 3’-UTR區，即 CXCR4為miR-206的靶基因，最后miR-206 inhibitor和CXCR4si-RNA共轉染實驗也證實了沉默CXCR4的表達能夠逆轉miR-206 inhibitor對牙髓干細胞的遷移的促進作用。由此可以認為，miR-206通過靶向調控CXCR4對hDPSCs的遷移能力發揮重要調控作用，提示miR-206在hDPSCs參與牙髓組織損傷修復過程中發揮重要作用。