miR-145-5p通過靶向ABCE1表達影響人肺腺癌A549細胞的增殖和遷移

于 潛，韓 旭，李曉倩，楊雪英*

0 引言

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的80%，具有致病因素及臨床癥狀多樣等特點[1]。肺腺癌是NSCLC重要的病理類型之一，其復發和轉移是導致患者死亡的主要因素。雖然目前以手術切除為主、放化療以及生物靶向治療為輔的綜合治療能夠在一定程度上減輕患者痛苦，但肺癌的死亡率仍逐年增加[2]。肺癌轉移是多基因參與的綜合過程，涉及到多種腫瘤轉移相關基因的結構和(或)功能異常[3-4]。因此，篩查和識別腫瘤轉移相關基因、探尋基因治療、為臨床提供新的診療靶點尤為重要。

微小RNA(microRNA，miR)屬于非編碼RNA家族中的一員，基因序列高度保守，廣泛存在于哺乳類動物中，通過與靶基因的3′非編碼區(3′Untranslated Regions,3′UTR)互補結合，抑制靶基因翻譯或降解，從而發揮其轉錄后基因調控功能，在細胞生長、分化、增殖過程中起關鍵作用，也是有待研發的肺癌基因治療的重要工具[5-6]。既往研究發現，miR-145-5p通過負性調控其靶基因表達參與多種腫瘤發生和轉移[7-9]，但其在NSCLC中的作用尚無報道。

ATP結合盒轉運蛋白E1(ABCE1)屬于ABC超家族的一員，能夠重新啟動翻譯，調控真核生物的蛋白合成，參與病毒衣殼的裝配過程，并在機體組織防御過程中發揮重要作用，與某些惡性腫瘤的發展密切相關[10-12]。前期研究顯示，肺腺癌及轉移淋巴結組織中，ABCE1表達明顯高于癌旁組織和正常肺組織，并通過Fe-S簇結構域調控細胞骨架，促進肺癌轉移[13-14]。

因此，本研究觀察miR-145-5p在肺癌組織和細胞系中的表達，通過改變miR-145-5p的表達水平，探討其與ABCE1可能存在的內在聯系以及在A549細胞侵襲及遷移中的作用和機制。

1 實驗方法

1.1 臨床資料收集 選取2018年1-6月于中國醫科大學附屬第四醫院行手術治療的20例肺腺癌患者，男10例，女10例，年齡40～72歲，平均(62.9±5.58)歲。所有患者術前均未進行放、化療。術中切除原發灶作為實驗樣本，同時切除距原發灶10 cm以上、且經病理醫生證實無癌組織侵犯的肺組織作為對照的癌旁組織。

1.2 A549細胞培養和轉染 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。A549細胞培養條件：10%胎牛血清的F12K培養基，37 ℃、5%CO2細胞培養箱。細胞進入對數生長期后，經PBS緩沖洗滌后，室溫下在100 μl DNA-氯化鈣-2-(二乙醇氨基)乙磺酸-緩沖鹽的混合物中靜置20 min。使用磷酸鈣法細胞轉染試劑盒(碧云天)將miR-145-5p的模擬物、抑制劑和陰性對照物分別轉染到A549細胞中孵育48 h。

1.3 miR-145-5p靶基因預測和驗證 生物信息學軟件TargetScan Human(http://www.targetscan.o rg/)列出能與ABCE1結合的所有miRs，根據互補堿基對長度、是否保守等因素初步確定為miR-145-5p。分別構建帶有野生型和突變型結合位點的熒光報告基因載體，通過測序確認克隆載體成功構建。將各組細胞接種于24孔板中，熒光報告載體與miR-145表達質粒和陰性對照質粒均轉染入A549 細胞株。48 h后按照試劑盒說明檢測A549細胞中螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，結果以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值表示。

1.4 MTT實驗 將各組細胞均以1×103個/孔的密度接種于96 孔板，接種細胞后2、12、24、36、48 h觀察細胞狀態，貼壁且生長狀態良好者繼續每孔加入180 μl 10% F12K培養基與20 μl 5 mg/ml MTT的混合培養液，繼續培養4 h后酶標儀OD 570 nm讀數。以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.5 劃痕愈合實驗 采用對數生長期、融合度超過90%的細胞，使用滅菌后Axygen 200 μl移液器吸頭垂直在24孔細胞培養板上劃線。PBS緩沖液徹底清洗劃線后的脫落細胞并拍照。劃痕后48 h觀察細胞，并再次對劃痕處進行拍照對比。

1.6 熒光定量PCR 使用TaqMan微小RNA試劑盒提取并通過qRT-PCR測定miR-145含量。Trizol提取各實驗組中A549細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。PCR的反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(30個循環)。溶解曲線參照儀器自動程序。使用U6和GAPDH作為內參，相對表達量以2-△△C法計算。引物序列為：miR-145-5p，上游：5′-ATC GTCCAGTTTTCCCAGG-3′，下游：5′-CGCCTCCACACACTCACC-3′;U6，上游：5′-ATTGGAACGATACAG AGAAGATT-3′，下游：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；ABCE1，上游：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCAGACAAGTTAACGAG-3′,下游：5′-TCCTTGTAGTCCATACCATCATCCAAGAAAAAGTAGTTTC-3′；GAPDH，上游：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′；下游：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

2 實驗結果

2.1 miR-145-5p在肺癌組織和人肺腺癌A549細胞系中的表達變化 與癌旁組織相比，miR-145-5p在人非小細胞肺癌組織中的表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1A；與293T工具細胞相比，miR-145-5p在人肺腺癌A549細胞系表達量亦顯著降低(P<0.05)，見圖1B。

2.2 ABCE1 miR-145-5p的靶基因 TargetScan生信預測軟件提示，ABCE1可能為miR-145-5p的靶基因，在3′UTR存在互補結合的堿基對(圖2A)。報告基因實驗顯示，在轉染miR-145-3p表達質粒的A549細胞中，共轉染野生型ABCE1-3′ UTR載體能夠顯著降低熒光素酶活性(P<0.05),見圖2B；而共轉染突變型ABCE1-3′UTR載體未見熒光素酶活性明顯變化(P>0.05)。在轉染miR-145-5p陰性表達對照質粒的A549細胞中熒光素酶活性均未見明顯改變(P>0.05)。

2.3 miR-145-5p表達的變化對A549細胞中ABCE1 mRNA表達的影響 轉染48 h后，PCR檢測結果顯示，在A549細胞中轉染miR-145-5p模擬物可顯著增加miR-145-5p的表達，降低ABCE1 mRNA的表達(P<0.05)，見圖3A；轉染miR-145-5p抑制物可顯著抑制miR-145-5p的表達，增加ABCE1 mRNA的表達(P<0.05)；轉染miR-145-5p陰性對照物沒有明顯變化(P>0.05)。

2.4 miR-145-5p表達的變化對A549細胞增殖能力的影響 MTT實驗結果顯示，與未轉染細胞相比，轉染miR-145-5p模擬物組在OD 570 nm時測定的吸光度數值明顯小于未轉染組、抑制物組和對照組，提示增殖能力降低(P<0.05)，見圖3B；抑制物組的吸光度明顯高于另外3組，提示增殖能力顯著增強(P<0.05)；而轉染陰性對照物組與未轉染組的吸光度數值比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 miR-145-5p表達的變化對A549細胞遷移能力的影響 細胞劃痕愈合實驗結果顯示，轉染后，與未轉染細胞相比，轉染miR-145-5p模擬物組的劃痕清晰，距離未見明顯縮短(P<0.05)，見圖3C；轉染抑制物組的劃痕距離明顯縮短，細胞遷移能力增強(P<0.05)，而轉染陰性對照物組的劃痕距離雖有改變，但遷移能力仍弱于抑制物組細胞(P>0.05)。

圖1 miR-145-5p在肺癌組織和人肺腺癌A549細胞系中的表達

圖2 miR-145-5p的靶基因預測和熒光素酶報告基因實驗驗證

注：A.Target ScanHuman生信數據庫預測miR-145-5p和ABCE1存在的結合部位，B.熒光素酶報告基因實驗證實ABCE1是miR-145-5p的靶基因。與共轉染miR-145-5p表達質粒和野生型ABCE1-3′UTR載體的A549細胞比較，**P<0.05

圖3 miR-145-5p表達變化對A549細胞中ABCE1表達、增殖和遷移能力的影響

注：A.PCR檢測轉染48 h后A549細胞中ABCE1 mRNA表達變化，B.MTT檢測轉染后A549細胞增殖能力變化，C.劃痕愈合實驗檢測轉染48 h后A549細胞遷移能力變化。與miR-145-3p過表達質粒ABCE1-3′UTR載體的A549細胞比較，**P<0.05

3 討論

miRs是一類長度約為18～22個核苷酸的非編碼RNAs。近年來，越來越多的研究證實，miRs表達水平和差異可作為癌癥診斷、治療和評估預后的重要指標[15-16]。在甲狀腺癌中，miR-145可由甲狀腺癌細胞分泌，通過調控靶基因AKT3的表達，進一步影響PI3K/Akt通路的活化，是促進甲狀腺癌生長的主要調節因素[17]。在胰腺導管腺癌中，外源性增加miR-145-5p的表達，可以通過降低靶基因Smad3的表達，從而促進細胞凋亡，抑制癌細胞的增殖和侵襲[18]。同樣，本研究發現，在肺腺癌中，癌組織和A549細胞系中miR-145-5p的表達均明顯下降，提示miR-145-5p與肺腺癌的發生發展關系密切。

通常，miR通過與靶基因3′UTR互補結合，在轉錄后水平負性調控靶基因的表達，從而發揮調控分化、免疫和腫瘤發展等多種生物學作用[16]。同樣，本研究通過TargetScan Human數據庫預測，在ABCE1 3′UTR的1118至1125位置存在7個連續與miR-145-5p互補的核苷酸，結合穩定性高，可能存在調控關系。進一步采用雙熒光素酶報告基因實驗，發現在共轉染miR-145-5p表達質粒和野生型ABCE1 3′UTR載體的A549細胞中熒光素酶活性顯著降低，而突變型載體沒有明顯變化，證實ABCE1是miR-145-5p的靶基因。此外，轉染人工合成的miRs產物從外源性改變miR-145-5p的表達，發現miR-145-5p的模擬物能夠明顯降低ABCE1的表達，而miR-145-5p抑制劑能明顯增加ABCE1的表達，兩者呈負相關，與熒光素酶報告基因結果一致。

轉染不同miRs產物對A549細胞的增殖和遷移能力有影響，與既往研究結果一致[17-18]。本研究發現，與未轉染或轉染陰性對照物的細胞相比，miR-145-5p的模擬物能夠明顯降低A549細胞中ABCE1 mRNA的表達，同時降低在OD 570 nm時測定的吸光度數值，縮短劃痕后的愈合遷移距離，表明A549細胞的增殖和遷移能力明顯下降；而轉染miR-145-5p抑制物組的A549細胞增殖和遷移能力明顯增強。

綜上所述，ABCE1是miR-145-5p的靶基因，外源性改變miR-145-5p的表達能夠通過負性調控ABCE1的變化，進一步改變人肺腺癌細胞A549的增殖和遷移能力。本研究揭示了肺腺癌轉移的新的機制，為臨床綜合治療提供了新的作用靶點。